1,25-二羥維生素D3對嚴重燙傷小鼠應激反應的影響.pdf

1、目的:
　　探討1，25-二羥維生素D3對嚴重燙傷小鼠應激狀態(tài)下胰島素抵抗和炎癥反應的影響。
　　方法:
　　1.建立30％全身體表面積(TBSA)Ⅲ°燙傷小鼠模型
　　選擇健康SPF級KM小鼠130只（中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心），雌雄各半，體質(zhì)量28～32 g，鼠齡6～8周。小鼠背部按30％ TBSA用6％Na2S試劑退毛，腹腔注射4％水合氯醛（40 mg·kg-1）麻醉，麻醉成功后將小鼠背部脫毛區(qū)置于1

2、00℃熱水中12s，制成燙傷面積為30％的Ⅲ°燙傷模型（病理切片證實，健康組不燙傷），傷后立即腹腔注射2 mL·kg-11％TBSA-1乳酸鈉林格液復蘇，傷后第2天給予半量。創(chuàng)面涂抹2％磺胺嘧啶銀霜抗感染1次/天。
　　2.實驗動物的分組
　　按隨機數(shù)字表法將小鼠分成4組，健康組（不燙傷）10只，實驗組Ⅰ（燙傷后用藥）、實驗組Ⅱ（燙傷后用藥）和對照組（燙傷后不用藥）各40只。分籠飼養(yǎng)各組，常規(guī)動物飼料喂食。建模成功后于每隔1

3、日晨8時，給予實驗組Ⅰ小鼠1，25-(OH)2VitD31μg·kg-1+0.6 mL花生油灌胃，給予實驗組Ⅱ小鼠1，25-(OH)2VitD34μg·kg-1+0.6 mL花生油灌胃，給予對照組小鼠0.6 mL花生油灌胃。1，25-(OH)2VitD3每隔1日晨8時灌胃一次，連續(xù)2周。
　　3.觀察指標
　　(1)空腹血糖(FBG)
　　實驗小鼠禁食過夜，于晨8時斷頭處死后取血。健康組小鼠一次處死，實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ

4、和對照組小鼠分別于燙傷后1、3、7、14d各處死10只。各組每次處死小鼠采血時用一次性血糖試紙和血糖儀即時測量FBG。
　　(2)空腹胰島素(FIns)
　　實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ和對照組分別于1、3、7、14d各處死10只小鼠時（健康組10只一次性處死），收集血液標本2 mL于3000 r/min、30 min、4℃離心。收集血清0.8 mL于-80℃保存，用于空腹胰島素測定。實驗結(jié)束時，將制備好的血清取0.5 mL置于樣品杯

5、中（剩余0.3 mL血清用于血清TNF-α的含量測定），放置于全自動化學發(fā)光免疫分析儀上（運用化學發(fā)光免疫法測量FIns的含量），調(diào)整好檢測參數(shù)后開始檢測，讀取光量子數(shù)，根據(jù)標準曲線計算出FIns含量。
　　(3)計算IR值
　　用穩(wěn)態(tài)模式法(HOMA)計算 HOMA-IR，公式為:HOMA-IR=FBG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5。
　　(4)小鼠血清TNF-α的含量測定
　　取出-80℃保

6、存的血清標本于常溫放置30 min后，用小鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒檢測小鼠血清TNF-α的濃度。
　　(5)免疫組織化學法測創(chuàng)面組織NF-κB陽性率
　　創(chuàng)面組織標本常規(guī)石蠟包埋切片，免疫組化試劑盒染色。NF-κB陽性呈棕黃色顆粒（主要在細胞漿和/或細胞核中表達）。高倍鏡下（×400倍）隨機讀取5個不同的視野，計數(shù)100個細胞及陽性細胞數(shù)，創(chuàng)面組織NF-κB陽性率(％)=（陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100％。

7、　　4.統(tǒng)計方法
　　用SPSS18.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和處理。計量資料均以(x)±s表示，采用單因素方差分析(ANOVA)，組間多重比較用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.各組小鼠空腹血糖(FBG)的測定
　　各組處死小鼠時用一次性血糖試紙和血糖儀即時測量FBG，檢測結(jié)果顯示實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ和對照組小鼠傷后不同時點FBG均高于健康組水平（實驗組Ⅱ第14天與健康組比較，P

8、＞0.05，余與健康組比較，P＜0.05）。同一時點不同組間比較，實驗組Ⅰ和實驗組Ⅱ小鼠傷后FBG均數(shù)均低于對照組水平，且實驗組Ⅱ低于實驗組Ⅰ;同一時點各組實驗小鼠傷后FBG比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.各組小鼠空腹血清胰島素(FIns)的測定
　　運用化學發(fā)光免疫法測量FIns的含量，實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ和對照組小鼠傷后不同時點HOMA-IR均數(shù)均高于健康組水平（實驗組Ⅱ第14天與健康組比較，P＞0.05

9、，余與健康組比較，P＜0.05）。同一時點不同組間比較，實驗組Ⅰ和實驗組Ⅱ小鼠傷后FIns均數(shù)均低于對照組水平，且實驗組Ⅱ低于實驗組Ⅰ;同一時點各組實驗小鼠傷后FIns比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.各組小鼠胰島素抵抗(IR)
　　健康組小鼠HOMA-IR均數(shù)為4.75±0.48。實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ和對照組小鼠傷后不同時點HOMA-IR均數(shù)均高于健康組水平（實驗組Ⅱ第14天與健康組比較，P＞0.05，余與健

10、康組比較，P＜0.05）。同一時點不同組間比較，實驗組Ⅰ和實驗組Ⅱ小鼠傷后HOMA-IR均數(shù)均低于對照組水平，且實驗組Ⅱ低于實驗組Ⅰ;同一時點各組實驗小鼠傷后HOMA-IR比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同一組不同時點比較，燙傷小鼠傷后第3天HOMA-IR均數(shù)達最高，以后逐漸降低;同一組內(nèi)燙傷小鼠傷后不同時點HOMA-IR比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。
　　4.各組實驗小鼠不同時點血清TNF-α含量的比較

11、　　健康組小鼠血清TNF-α含量為（364.10±46.13）ng/L。實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ和對照組小鼠傷后不同時點血清TNF-α含量均數(shù)均高于健康組水平，實驗組Ⅱ小鼠傷后第14天血清TNF-α含量均數(shù)接近于健康組水平（實驗組Ⅱ第14天與健康組比較，P＞0.05;余與健康組比較，P＜0.05）。同一時點不同組間比較，實驗組Ⅰ和實驗組Ⅱ小鼠傷后血清TNF-α含量均數(shù)均低于對照組水平，且實驗組Ⅱ低于實驗組Ⅰ;同一時點各組實驗小鼠傷后血清TNF

12、-α含量均數(shù)兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同一組不同時點比較，燙傷小鼠傷后血清TNF-α含量均數(shù)第1天最高，以后逐漸降低;同一組內(nèi)燙傷小鼠傷后不同時點血清TNF-α含量比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5.各組實驗小鼠創(chuàng)面組織NF-κB免疫組織化學染色結(jié)果
　　健康組小鼠皮膚組織NF-κB表達的陽性率為（13.67±6.28）％。實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ和對照組小鼠傷后不同時點創(chuàng)面組織NF-κB表達的陽性

13、率均數(shù)均高于健康組水平，實驗組Ⅱ小鼠傷后第7天創(chuàng)面組織NF-κB表達的陽性率均數(shù)接近于健康組水平(實驗組Ⅱ第7天與健康組比較，P＞0.05;余與健康組比較，P＜0.05)。同一時點不同組間比較，實驗組Ⅰ和實驗組Ⅱ小鼠傷后創(chuàng)面組織NF-κB表達的陽性率均低于對照組水平，且實驗組Ⅱ低于實驗組Ⅰ;同一時點各組實驗小鼠傷后創(chuàng)面組織NF-κB表達的陽性率比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同一組不同時點比較，燙傷小鼠傷后創(chuàng)面組織NF-κB表達

14、的陽性率均數(shù)第1天最高，以后逐漸降低;同一組內(nèi)燙傷小鼠傷后不同時點創(chuàng)面組織NF-κB表達的陽性率較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ和對照組小鼠傷后空腹血糖(FBG)、空腹血清胰島素(FIns)較健康組明顯升高，證明30％全身體表面積(TBSA)Ⅲ°燙傷小鼠模型建模成功（病理切片證實），產(chǎn)生明顯胰島素抵抗(IR)。
　　2.對照組與實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ小鼠空腹血糖(FBG)、空腹

15、血清胰島素值(FIns)比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，證明1，25-(OH)2VitD3能有效控制胰島素抵抗(IR)。
　　3.實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ和對照組小鼠傷后不同時相點血清TNF-α含量兩兩比較和同一組內(nèi)不同時相點兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗組Ⅰ、實驗組Ⅱ和對照組小鼠傷后不同時相點創(chuàng)面組織NF-κB表達的陽性率兩兩比較和同一組內(nèi)不同時相點兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。1，25-