1,25-二羥維生素D3對哮喘小鼠氣道重塑及氣道上皮細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景:
　　支氣管哮喘(簡稱哮喘，asthma)是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組份介導(dǎo)的氣道慢性炎癥性疾病，是全球最常見的慢性呼吸道疾病之一，也是終生發(fā)病率最高的慢性疾病之一。哮喘嚴(yán)重影響個(gè)人健康且?guī)砭薮笊鐣?huì)負(fù)擔(dān)，全球?qū)W者致力于其發(fā)病機(jī)制和防治方法的研究。氣道重塑是哮喘特征之一，被認(rèn)為是引起不可逆性呼吸道氣流受限和持續(xù)的氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness，AHR)的重要原因，是導(dǎo)致哮喘難治的病理基礎(chǔ)。目前

2、常用的治療哮喘的藥物在改善氣道重塑方面療效并不確切，對氣道重塑發(fā)病機(jī)制及治療方法的研究是目前哮喘研究中的熱點(diǎn)。1，25-二羥維生素D3(1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25-(OH)2D3)傳統(tǒng)上被人們認(rèn)為是人體不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)，但近年研究發(fā)現(xiàn)作為一種甾體激素，其作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止于此。哮喘方面，目前研究發(fā)現(xiàn)1，25-(OH)2D3可能通過基因、抗感染、影響肺發(fā)育、增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素反應(yīng)性等機(jī)制同哮喘發(fā)生、哮喘控制、哮喘患

3、者糖皮質(zhì)激素敏感性有關(guān)，有研究顯示1，25-(OH)2D3還可能減輕氣道重塑。氣道上皮損傷在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用越來越受到重視，一系列研究表明哮喘的發(fā)病及臨床表現(xiàn)都同氣道上皮物理屏障及生物屏障功能改變之間存在聯(lián)系。氣道上皮細(xì)胞(airwayepithelial cells，AECs)凋亡是上皮損傷的其中一種表現(xiàn)，生理?xiàng)l件下AECs的凋亡是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)所需，但病理?xiàng)l件下AECs的過度凋亡是有害的，同氣道炎癥、氣道重塑及AHR均有關(guān)。目前研

4、究對哮喘中AECs凋亡程度報(bào)道不一致。眾多研究顯示1，25-(OH)2D3對細(xì)胞凋亡的作用呈現(xiàn)雙向性，而1，25-(OH)2D3對AECs凋亡的影響目前尚未見報(bào)道。本研究通過建立哮喘氣道重塑小鼠模型，探討1，25-(OH)2D3是否能抑制哮喘氣道重塑、哮喘中AECs凋亡情況、1，25-(OH)2D3對哮喘AECs凋亡的影響。
　　研究目的:
　　觀察1，25-(OH)2D3對哮喘小鼠氣道重塑及AECs凋亡的影響。
　　

5、研究方法:
　　1.清潔級雌性Balb/c小鼠60只，體重17g-19g，隨機(jī)分為3組:正常對照組（A組）、哮喘組（B組）和1，25-(OH)2D3干預(yù)組（C組），每組各20只。以卵蛋白(ovalbumin，OVA)致敏和激發(fā)的方法制備小鼠慢性哮喘模型。末次激發(fā)后24h內(nèi)一半小鼠腹腔戊巴比妥注射麻醉，氣管切開插管，測定基礎(chǔ)肺功能及不同濃度梯度(0.025、0.05、0.1、0.2mg/kg)乙酰甲膽堿(Ach)激發(fā)下的肺功能，測量

6、指標(biāo)包括吸氣阻力(inspiratory resistance，Ri)、呼氣阻力（expiratory resistance，Re）、動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(dynamic compliance，Cdyn);另一半小鼠處死后行氣道重塑相關(guān)指標(biāo)檢測。肺組織HE染色，光鏡下找到完整的支氣管橫斷面，應(yīng)用圖象分析軟件測定支氣管基底膜周徑(basement membrane perimete，Pbm)、管壁總面積(total wall area，Wat)，并

7、用Pbm將測得的Wat標(biāo)準(zhǔn)化，以Wat/Pbm代表支氣管管壁厚度。肺組織石蠟切片分別行阿利辛蘭-過碘酸雪夫(AB-PAS)染色、Masson三聯(lián)染色、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)免疫組織化學(xué)染色觀察氣道粘液分泌情況、膠原纖維增生情況及氣道平滑肌厚度，結(jié)果分別以AB-PAS染色陽性面積/Pbm(AB-PAS(+)area/Pbm)、Masson染色陽性面積/Pbm(Wcol/Pbm)、α-S

8、MA染色陽性面積/Pbm(α-SMA(+)area/Pbm)來表示。
　　2.小鼠肺組織石蠟切片經(jīng)末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL法)檢測AECs凋亡情況，結(jié)果以凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)表示;免疫組織化學(xué)染色檢測氣道上皮Bcl-2的表達(dá)，結(jié)果以平均光密度(optical density，

9、OD)值表示。
　　研究結(jié)果:
　　1.肺功能:A、B、C組小鼠Ri分別為(1.16±0.06)、(1.49±0.08)、(1.29±0.05)cmH2O/(ml/s); Re分別為（1.02±0.15）、（1.48±0.16））、(1.29±0.07) cmH2O/(ml/s);Cdyn分別為(0.03±0.03)、(0.02±0.04)、(0.02±0.02)ml/cmH2O。B、C組Ri及Re均較A組升高，Cdyn均較

10、A組減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）;C組小鼠Ri、Re較B組下降(P＜0.05)。Ach激發(fā)時(shí)B、C組呈現(xiàn)氣道高反應(yīng)性。各濃度梯度Ach激發(fā)下，Ri、Re同基礎(chǔ)值相較變化的百分?jǐn)?shù)B、C組無明顯差異;Ach濃度達(dá)到0.2mg/kg時(shí)，C組Cdyn下降程度小于B組(P＜0.05)。
　　2.肺組織病理(HE染色):光鏡下，A組小鼠支氣管黏膜上皮、黏膜肌層、肺組織結(jié)構(gòu)完整整齊，支氣管管腔規(guī)則，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。B組小鼠管

11、腔狹窄，氣道壁明顯增厚，支氣管黏膜增厚，可見黏液栓堵塞及支氣管粘膜上皮脫落，氣道平滑肌層增厚，支氣管周圍及粘膜下有大量炎性細(xì)胞浸潤。C組氣管壁增厚及管周炎癥方面較B組小鼠有所減輕。A、B、C組小鼠Wat/Pbm分別為(7.79±1.01)、(19.24±1.70)、(14.12±2.13)um2/um。B、C組均明顯高于A組（t值分別為11.78、6.51，P值均＜0.05），C組低于B組（t值為5.26，P＜0.05）。
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12、.粘液分泌(AB-PAS染色):AB-PAS染色陽性信號為藍(lán)色（酸性粘液）、紅色（中性粘液）或混合呈紫紅色。鏡下A組不見或僅見點(diǎn)狀A(yù)B-PAS染色陽性信號。B組氣管上皮內(nèi)AB-PAS染色陽性信號面積明顯增加。C組較A組也明顯增加，但較B組有所減少。A、B、C組小鼠AB-PAS(+)area/Pbm分別為（0.04±0.02）、（5.22±0.90）、（3.71±0.56）um2/um。B、C組均明顯高于A組（P值均＜0.01），C組低于

13、B組(P＜0.05)。
　　4.膠原纖維沉積(Masson染色):氣道上皮下膠原纖維染為綠色。A組膠原纖維為極薄一層環(huán)繞氣管。B組氣道上皮下膠原沉積明顯增加，形成一較厚致密層。C組膠原沉積較A組也明顯增加，但較B組有所減少。A、B、C組小鼠Wcol/Pbm分別為(1.37±0.25)、（7.63±1.55）、（4.31±0.65）um2/um。B、C組均明顯高于A組（t值分別為11.02、5.18，P值均＜0.05），C組低于B組

14、（t值為5.83，P＜0.05）。
　　5.氣道平滑肌厚度(α-SMA免疫組織化學(xué)染色):氣道平滑肌層染為棕黃色。A組氣管壁α-SMA免疫組織化學(xué)染色陽性可見，為極薄一層環(huán)繞氣管。B、C組α-SMA免疫組織化學(xué)染色陽性區(qū)域明顯增厚，C組較B組減輕。A、B、C組小鼠α-SMA(+)area/Pbm分別為(1.40±0.24)、(5.40±0.69)、(3.27±0.46) um2/um。B、C組均明顯高于A組（t值分別為13.89、

15、6.50，P值均＜0.05），C組低于B組(t值為7.38，P＜0.05)。
　　6.AECs凋亡(TUNEL):細(xì)胞核染為棕黃色者為凋亡細(xì)胞。A組小鼠AECs中不見或偶見TUNEL(+)的細(xì)胞。B、C組小鼠AECs中TUNEL(+)者明顯增多，C組TUNEL(+)細(xì)胞比率較B組降低。A、B、C組小鼠AECs的AI值分別為(0.0045±0.0038)、(0.2973±0.0574)、(0.1489±0.0175)。B、C組相較有

16、顯著差異(P＜0.01)。
　　7.Bcl-2免疫組織化學(xué)染色:陽性細(xì)胞胞漿或胞核呈棕黃色。A組小鼠氣道上皮組織表達(dá)較多Bcl-2蛋白，B組小鼠Bcl-2表達(dá)很少，C組小鼠可見Bcl-2表達(dá)，但含量較A組降低。A、B、C組小鼠氣道上皮Bcl-2免疫組化OD值分別為(0.1603±0.0209)、(0.0912±0.0230)、(0.1139±0.0086)，B、C組均明顯低于A組（t值分別為7.44、3.52，P值均＜0.05），