1,25-二羥維生素D3聯(lián)合特異性免疫療法對小鼠哮喘模型的作用及其機制.pdf

1、目的：
　　 支氣管哮喘(簡稱哮喘)是常見的慢性呼吸道疾病之一。近年來，其患病率在全球范圍內(nèi)呈逐年增加的趨勢。過敏性哮喘是在過敏原刺激下，由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性變應性炎癥，其發(fā)病機制尚未完全闡明[1-3]。過敏性哮喘的特征為嗜酸性粒細胞浸潤為主的氣道炎癥和氣道高反應性[4，5]。其中，免疫-炎癥反應是哮喘發(fā)病的重要機制，抗原通過抗原呈遞細胞(antigen presenting cell，APC)激活T細胞，活化的輔

2、助性T細胞(主要是Th2細胞)產(chǎn)生白細胞介素(IL)-4、IL-5、IL-10和IL-13等進一步激活B細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞及肺泡巨噬細胞等多種炎癥細胞，造成氣道炎癥反應。因此，在過敏性哮喘中，過敏原通過APC激活T細胞是發(fā)生氣道炎癥的重要始動環(huán)節(jié)。
　　 特異性免疫療法(specific immunotherapy，SIT)通常稱為脫敏治療。SIT為治療過敏性支氣管哮喘提供了不同于常規(guī)藥物(如腎上腺糖皮質激素，氨茶堿和

3、β2-受體激動劑等)的治療方法，是目前已知唯一針對哮喘病因的治療，成功的SIT可改變過敏性疾病的自然病程[6，7]。既往受到接種疫苗治療傳染性疾病獲得巨大成功的啟示，早在1911年，Noon和Freeman開始使用特異的過敏原治療過敏性疾病[21]。從那時起，皮下SIT在臨床治療中逐漸得到發(fā)展和完善。近一個世紀，皮下SIT被認為是治療過敏性疾病(例如，對昆蟲毒液，屋塵螨，花粉或動物皮屑等過敏)的一種重要的治療措施[8，9]。
　　

4、 SIT的作用機制尚不完全清楚[10，11]。目前認為，SIT主要是通過改變機體的免疫狀態(tài)而達到治療過敏性疾病的作用，成功的SIT能夠誘發(fā)過敏機體對特異性抗原產(chǎn)生耐受，期間誘導產(chǎn)生的調節(jié)性T細胞(T regulatory cells，Tregs)發(fā)揮了重要作用[10-14]。但是，由于脫敏治療存在可能誘發(fā)過敏性不良反應(如嚴重的過敏性休克)、療程長以及療效個體差異較大等原因，影響了該療法的臨床應用[15]。因此，需要不斷深入探討改善S

5、IT治療過敏性哮喘的方法及其機制。
　　 1，25二羥維生素D3[1，25(OH)2D3，VitD3]是維生素D的活性代謝產(chǎn)物。VitD3除在骨形成和鈣的代謝過程中具有重要作用外，還通過表達在APC和活化的T細胞中的特異性受體發(fā)揮免疫調節(jié)作用[16]。在與免疫調節(jié)相關的疾病研究中發(fā)現(xiàn)，VitD3不僅可以預防人類1型糖尿病[17]和炎癥性腸病動物模型的發(fā)病[18]，還能夠延長同種異體移植存活期，減輕急、慢性排斥反應[19]。Vit

6、D3還可誘導單核細胞源性不成熟樹突狀細胞(immature dendritic cells，imDCs)表面抗原呈遞分子MHCⅡ和共刺激分子CD40，CD80和CD86的表達量下調，影響免疫過程[20]。
　　 鑒于在既往的研究中顯示SIT和VitD3兩者都有助于形成免疫耐受，可對變應性疾病發(fā)揮治療作用，本實驗觀察了使用VitD3預處理聯(lián)合SIT在使用卵蛋白(ovalbumin，OVA)致敏小鼠哮喘模型中對氣道炎癥、Th1/Th

7、2相關的細胞因子分泌、OVA特異性IgE、小鼠脾源性DCs表面共刺激分子表達和對Tregs極化的作用；并探討了使用rmIL-4、rmGM-CSF聯(lián)合VitD3誘導骨髓源性樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)，觀察DCs在加用OVA和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激對髓源性DCs中Notch信號配體Jagged1和Jagged2表達的影響。為探討使用VitD3作為佐劑，聯(lián)合SIT治療過敏性哮喘提供

8、實驗基礎。
　　 方法：
　　 一、體內(nèi)實驗：探討VitD3處理聯(lián)合SIT對哮喘小鼠氣道炎癥的作用及其機制
　　 1.實驗分組：使用BALB/c小鼠(6～8周齡，18～24g)75只，隨機分為5組(15只/組)分別為正常對照組，哮喘模型組，VitD3處理組，免疫治療組，VitD3+免疫治療組(簡稱為，聯(lián)合處理組)。其中復制OVA致敏(佐劑為氫氧化鋁凝膠)-脫敏-激發(fā)的小鼠模型，作為小鼠哮喘模型，并使用H.E染色的

9、方法鑒定。
　　 2.實驗程序：模型制作和處理程序簡述如下，除外正常對照組外，其余小鼠致敏使用OVA10μg+Al(OH)32 mg，分別于d0和d7進行腹腔注射。正常對照組使用PBS0.1 ml進行致敏。兩周之后，除外正常對照組、哮喘模型組和VitD3預處理組之外，另外兩組免疫治療使用OVA100μg分別于d21、d23和d25，在尾根部進行皮下注射。正常對照組和哮喘模型組使用PBS0.1 ml，進行尾根部皮下注射。在每次進行

10、OVA或PBS免疫治療前24 h(d20，d22和d24)，除外正常對照組、哮喘模型組和免疫治療組之外，其余兩組預處理分使用VitD350 ng進行腹腔注射。10天之后，除外正常對照小鼠組，其余4組小鼠使用1％OVA的PBS溶液進行超聲霧化吸入，每天30min，時間為d35、d38和d41。所有小鼠在最后一次霧化吸入24 h后即d42，進行各項檢查。
　　 3.支氣管肺泡灌洗：在最后一次激發(fā)24h后，收集上述各組中支氣管肺泡灌洗

11、液(BALF)，離心分離，獲得的沉淀使用瑞氏-姬姆薩染色檢測其中的細胞總數(shù)和分類；得到的上清液，使用ELISA檢測氣道炎癥檢測IL-4，IL-5，IL-10和IFN-γ水平。
　　 4.收集外周血：各組小鼠在進行最后一次激發(fā)后24h，采用眼球摘除法收集外周血，分離血清，使用ELISA檢測血清中OVA特異的IgE(sIgE)水平。
　　 5.采集脾臟：分離、純化各組脾臟中的DCs，使用流式細胞儀檢測DCs表面的共刺激分子C

12、D11c、CD80和CD86的表達情況；
　　 分離、純化小鼠脾臟CD4+淋巴細胞細胞，流式檢測各組小鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+T細胞的百分比值。
　　 4.留取肺標本：將各組中小鼠左肺上葉，10％福爾馬林固定，組織切片后進行H.E染色。
　　 二、體外實驗：探討加用VitD3誘導骨髓源性DCs被OVA和LPS刺激后Jagged1和Jagged2的表達變化
　　 1.培養(yǎng)鑒定骨髓源性DCs：拉

13、頸脫臼法處死小鼠，取小鼠股骨、脛骨骨髓，使用rmIL-4(10 ng/ml)、rmGM-CSF(20 ng/ml)連續(xù)培養(yǎng)10d，誘導骨髓源性樹突狀細胞。通過導致光學顯微鏡觀察、掃描電鏡檢查細胞形態(tài)，并使用流式檢測DCs表面標志性分子(CD11c、CD80和CD86)的表達，鑒定小鼠骨髓源性DCs。
　　 2.檢測VitD3對誘導骨髓源性DCs中Jagged1和Jagged2表達的變化
　　 實驗分組：在未加用、加用Vi

14、tD3培養(yǎng)出來的兩類DCs中，根據(jù)培養(yǎng)后期加入的刺激物不同，各自分為對照組，OVA組，LPS組和OVA+LPS組。
　　 實驗程序：如上方法制備小鼠骨髓細胞，以1×107/孔加入6孔培養(yǎng)板中，于0d每孔加入rmGM-CSF(20 ng/ml)、rmIL-4(10 ng/ml)，3d、5d和7d進行半量換液(同時補充rmGM-CSF、rmIL-4，在加用VitD3培養(yǎng)時，還要同時加入VitD3(1 nmol/L)。，8d加入OVA

15、(100μg/ml)或/和LPS(1μg/ml)，9d再次半量換液(同時補充rmGM-CSF、rmIL-4，OVA或/和LPS)，48h后即d10收獲細胞提取的mRNA和蛋白，使用RT-PCR和Western blotting法分別檢測Jageed1和Jagged2的表達。
　　 結果：
　　 1.BALF中嗜酸性粒細胞計數(shù)：BALF中的嗜酸性粒細胞計數(shù)，在正常對照組為0.16±0.02×104/ml，哮喘模型組為21.

16、84±2.91×104/ml，哮喘模型組比正常對照組顯著增高(P<0.05)；VitD3組為15.73±1.69×104/ml，免疫治療組為13.41±1.67×104/ml，聯(lián)合處理組為7.46±1.34×104/ml，VitD3組和免疫治療組分別與哮喘模型組相比BALF中的嗜酸性粒細胞計數(shù)雖有下降，但是均無顯著降低(P>0.05)。聯(lián)合處理組與哮喘組相比，則有顯著降低(P<0.05)，聯(lián)合處理組與免疫治療組相比顯著降低P<0.05)

17、，但與正常對照組相比仍有顯著增高(P<0.05)。
　　 2.肺部病理改變：肺組織切片進行H.E染色，與正常對照組小鼠肺臟相比較，哮喘模型組小鼠肺臟的體積增大、腫脹?？梢娭夤芗把苤車写罅康难仔约毎?以嗜酸性粒細胞和淋巴細胞為主)。氣管內(nèi)皮部分脫落，基底膜增厚形態(tài)不規(guī)則；VitD3組或只免疫治療組，可減輕小鼠肺組織的氣管基底膜增厚、大量炎癥細胞浸潤和氣道上皮脫落；聯(lián)合處理組炎癥細胞浸潤和氣道上皮損傷明顯減輕。
　　

18、 3.血清中sIgE水平：檢測小鼠血清中sIgE發(fā)現(xiàn)，正常對照組為0.16±0.05 ODunits，哮喘模型組為0.93±0.08 OD units，哮喘組比正常對照組顯著增高(P<0.05)；VitD3組為0.644±0.07 OD units，免疫治療組為0.75±0.06 OD units，聯(lián)合處理組為0.42±0.06 OD units，VitD3組和免疫治療組分別與哮喘模型組相比血清中的IgE水平雖有下降，但是均無顯著降低

19、(P>0.05)。聯(lián)合處理組與哮喘組相比，則有顯著降低(P<0.05)，聯(lián)合處理組比免疫治療組顯著降低(P<0.05)，但與正常對照組相比仍有顯著增高(P<0.05)。
　　 4.BALF中細胞因子水平：檢測小鼠BALF中IL-4水平，正常對照組為31.51±8.32pg/ml，哮喘模型組為58.24±12.51 pg/ml，哮喘組比正常對照組顯著增高(P<0.05)；VitD3組為57.43±8.91 pg/ml，免疫治療組為

20、43.75±6.42 pg/ml，聯(lián)合處理組為7.63±7.87pg/ml，VitD3組、免疫治療組和聯(lián)合處理組分別與哮喘模型組相比BALF中的IL-4水平雖有下降，但是均無顯著降低(P>0.05)。
　　 BALF中IL-5水平，正常對照組為28.72±5.86 pg/ml，哮喘模型組為74.62±14.22pg/ml，哮喘組比正常對照組顯著增高(P<0.05)；VitD3組為63.35±11.76 pg/ml，免疫治療組為4

21、9.14±17.35 pg/ml，聯(lián)合處理組為39.97±11.93 pg/ml，VitD3組和免疫治療組分別與哮喘模型組相比，BALF中的IL-5水平雖有下降，但是均無顯著降低(P>0.05)。聯(lián)合處理組與哮喘組相比，則有顯著降低(P<0.05)。
　　 BALF中IL-10水平，正常對照組為42.40±9.54 pg/ml，哮喘模型組為37.61±7.63pg/ml，哮喘組比正常對照組雖有下降，但無顯著降低(P>0.05)；

22、VitD3組為54.33±17.21 pg/ml，免疫治療組為44.62±13.81 pg/ml，聯(lián)合處理組為67.14±12.57pg/ml，VitD3組和免疫治療組分別與哮喘模型組相比，BALF中的IL-10水平雖有上升，但是均無顯著升高(P>0.05)。聯(lián)合處理組與哮喘組相比，則有顯著升高(P<0.05)。
　　 5.脾源性樹突狀細胞表面共刺激分子CD80和CD86表達：脾源性DCs表面共刺激分子CD80，在正常對照組為7

23、2.26±3.24％，哮喘模型組為85.37±4.06％，哮喘模型組比正常對照組CD80的表達顯著上調(P<0.05)；VitD3組為68.71±8.72％，免疫治療組為75.27±5.13％，聯(lián)合處理組為64.46±2.75％，VitD3組和免疫治療組中CD80比哮喘模型組表達均有降低，但無顯著降低(P>0.05)，只有聯(lián)合治療組比哮喘模型組顯著降低(P<0.05)。
　　 脾源性DCs表面共刺激分子CD86，在正常對照組為7

24、0.41±7.23％，哮喘模型組為80.72±9.47％，哮喘模型組比正常對照組CD80的表達無顯著上調(P>0.05)；VitD3組為57.82±6.21％，免疫治療組為64.75±4.28％，聯(lián)合處理組為50.14±3.51，VitD3組和免疫治療組中CD86表達比哮喘模型組均有降低，但無顯著降低(P>0.05)，只有聯(lián)合治療組比哮喘模型組顯著降低(P<0.05)。
　　 6.脾源性CD4+CD25+Foxp3+T：檢測脾源

25、性CD4+CD25+Foxp3+T占CD4+T細胞的百分比值，正常對照組為5.45±0.63％，哮喘模型組為3.61±0.47％，哮喘模型組比正常對照組顯著降低(P<0.05)；VitD3組和免疫治療組均較哮喘組百分比值上升，但均無顯著增加(P>0.05)；聯(lián)合處理組百分比值為5.22±0.53％，較哮喘組顯著增高(P<0.05)。
　　 7.骨髓源性樹突狀細胞中Jagged1和Jagged2的mRNA和蛋白的表達
　　

26、 不加VitD3，只常規(guī)使用rmGM-CSF和rmIL-4誘導小鼠BMDCs，經(jīng)OVA和LPS進行誘導48h之后，檢測Jagged1 mRNA的表達，結果顯示：OVA組、LPS組比對照組Jagged1的mRNA表達均有增加，但無顯著性差別(P>0.05)，OVA+LPS組比對照組Jagged1的mRNA表達顯著增加(P<0.01)。與Jagged1的表達相似，在OVA組、LPS組比對照組，Jagged2的mRNA表達均有增加，但無顯著性

27、差別(P>0.05)，OVA+LPS組比對照組Jagged2的mRNA表達顯著增加(P<0.01)。
　　 加用VitD3與rmGM-CSF、rmIL-4共同誘導的小鼠BMDCs，經(jīng)OVA和LPS進行誘導48 h之后，檢測Jagged1和Jagged2 mRNA的表達，結果顯示，OVA組、LPS組和OVA+LPS組與對照組相比，均略有升高，但無統(tǒng)計學差異。
　　 在無VitD3處理后的BMDCs在使用OVA刺激時，在15

28、0KDa和130KDa處分別可見Jagged1、Jagged2蛋白表達條帶，兩組比和對照組表達量略有增多，OVA+LPS組Jagged1和Jagged2蛋白表達明顯增加；加用VitD3后，OVA組、LPS組和OVA+LPS組Jagged1和Jagged2蛋白表達和對照組PBS刺激相比，均無明顯增加。
　　 結論：
　　 1.在小鼠OVA致敏哮喘模型中，使用VitD3預處理能夠增強SIT的治療作用，表現(xiàn)為減輕哮喘氣道的炎癥

29、，糾正Th1/Th2偏移，使脾源性DCs共刺激分子CD80、CD86表達降低以及誘導Tregs增加。
　　 2.在使用VitD3聯(lián)合rmIL-4，rmGM-CSF聯(lián)合誘導小鼠髓源性DCs后，加用OVA，LPS刺激，可明顯降低DCs表面Notch配體Jagged1和Jagged2的mRNA和蛋白的表達。Jaagged1和Jagged2表達的降低，可能是VitD3參與免疫調節(jié)機制之一。
　　 本文的結果證明，使用VitD3處