富血小板血漿及IGF-1對(duì)人脂肪來(lái)源干細(xì)胞體外成脂分化的影響及比較.pdf

1、本文主要從以下兩個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 人脂肪來(lái)源干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的：探索人脂肪來(lái)源干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的分離及體外培養(yǎng)方法，觀察其體外增殖特點(diǎn)、表面標(biāo)記特征及成脂成骨分化能力。
　　方法：取20-30歲成年健康女性吸脂手術(shù)中抽吸脂肪組織，Ⅰ型膠原酶消化法獲取人原代ADSCs，貼壁法培養(yǎng)、傳代，并測(cè)定生長(zhǎng)曲線。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第3代人脂肪干細(xì)胞

2、表面標(biāo)記（CD11b/c、CD29、CD45、CD90）。取第3代人脂肪干細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，油紅O染色法鑒定成脂分化情況。取第3代人ADSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，并用茜素紅染色法鑒定成骨分化情況。
　　結(jié)果：采用Ⅰ型膠原酶消化人脂肪組織、過濾、離心、貼壁法分離純化后得到的ADSCs純度較高，生長(zhǎng)曲線呈S形，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或多角形，在體外可快速穩(wěn)定擴(kuò)增。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD45、CD11b/c表達(dá)呈陰性，CD29、CD90表達(dá)呈陽(yáng)性。第3代人

3、脂肪干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后，油紅O染色可觀察到細(xì)胞內(nèi)有明顯的脂滴形成；成骨誘導(dǎo)完成后，茜素紅染色可見細(xì)胞內(nèi)有明顯的鈣化結(jié)節(jié)形成。
　　結(jié)論：用吸脂手術(shù)中吸取的脂肪，經(jīng)I型膠原酶消化并分離純化可以得到純度較高的ADSCs，體外可穩(wěn)定迅速增殖及傳代。人脂肪干細(xì)胞表達(dá)特定的表面標(biāo)記、具備多向分化潛能，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。
　　第二部分 富血小板血漿（PRP）和胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）對(duì)人ADSCs體外成脂分化的影響及比較。<

4、br>　　目的：探討人富血小板血漿（PRP）的分離提取方法，觀察PRP及IGF-1對(duì)體外培養(yǎng)人脂肪來(lái)源干細(xì)胞成脂分化的影響，觀察兩者對(duì)ADSCs成脂分化的作用差異，并初步探討作用機(jī)制，為PRP應(yīng)用于臨床脂肪移植提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：1.用血常規(guī)檢驗(yàn)管抽取每位志愿者30ml全血，混合均勻置于冰上。用2次離心法獲取PRP。至檢驗(yàn)科檢驗(yàn)全血及PRP血小板含量。2.用IGF-1及二次離心法提取的人PRP對(duì)人ADSCs進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分為

5、對(duì)照組、PRP組、IGF-1組，每組三個(gè)復(fù)孔。各組成脂誘導(dǎo)9天后，進(jìn)行油紅O染色，甘油封片，正置相差顯微鏡400倍下拍照，每張片子隨機(jī)5個(gè)視野。用IPP軟件對(duì)各組脂滴個(gè)數(shù)、面積等進(jìn)行分析比較。3.RT-PCR檢測(cè)成脂誘導(dǎo)過程中PPAR-gamma表達(dá)量，分組為對(duì)照組、PRP組、IGF-1組。按照分組條件進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，4d后結(jié)束誘導(dǎo)，提取各組總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，電泳后，在紫外燈下觀察比較目的基因條帶。拍照后，

6、用Image-J軟件分析比較條帶灰度值。
　　結(jié)果：通過二次離心的方法提取PRP，每30ml血液可獲得PRP4ml，檢驗(yàn)得PRP中血小板的含量為全血的8倍。成脂誘導(dǎo)9天后進(jìn)行油紅O染色，分析脂滴個(gè)數(shù)及面積發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組脂滴個(gè)數(shù)及面積明顯小于兩實(shí)驗(yàn)組，而PRP組的各分析指標(biāo)小于IGF-1組。RT-PCR結(jié)果顯示：IGF-1組PPAR-gamma表達(dá)量最多，其次為PRP組，其次為對(duì)照組。
　　結(jié)論：二次離心法可以獲得有效穩(wěn)定且血小