血管基質(zhì)片段細(xì)胞促進(jìn)游離脂肪移植后再生機制的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　因外傷、疾病、衰老和先天畸形所造成的軟組織缺損一直是整形外科學(xué)面臨的常見問題。為解決上述問題，膠原注射、真皮移植、人工合成材料植入等軟組織填充方法被廣泛應(yīng)用于臨床。1889年，Vander Meulen首先報道了脂肪組織的自體移植，至今已有百余年的歷史。自體脂肪移植具有的低免疫原性、供區(qū)低損傷、操作簡便等優(yōu)點使得這項技術(shù)自上世紀(jì)30年代起便被廣泛應(yīng)用于整形外科。
　　盡管脂肪移植效果明顯，但長期移植的效

2、應(yīng)難以控制，其高吸收率、低存活率、多并發(fā)癥，限制了它在臨床中的應(yīng)用。游離脂肪移植物也面臨著脂肪液化、移植物吸收、纖維組織替代等問題，它使得移植物隨時間推移的最終保存量僅為最初體積的40-60％。研究發(fā)現(xiàn)，在移植早期，脂肪移植物缺乏有效的血液供應(yīng)而處于急性缺血缺氧狀態(tài)。在移植物與宿主建立充分的血供之前，脂肪組織只能靠周圍組織液的浸潤和滲透來維持營養(yǎng)供應(yīng)，這時中央部分的脂肪組織已經(jīng)由于缺血缺氧時間過長，發(fā)生了壞死、液化。由此可見，在自體顆粒

3、脂肪移植后的轉(zhuǎn)歸過程中，移植早期建立及時、充分的血供，移植物及時地再血管化是影響其成活體積的關(guān)鍵。因此，如何促進(jìn)移植物在短時間內(nèi)血管化以提高移植脂肪的存活率成為了當(dāng)前研究的焦點。
　　近年來隨著人們對干細(xì)胞研究的不斷深入，利用干細(xì)胞移植療法來促進(jìn)移植物的再血管化，為有效促進(jìn)移植組織再血管化展示了美好的前景。Makoto等研究證明脂肪組織來源的干細(xì)胞（Adipose derived stem cells，ASCs）可促進(jìn)大鼠后肢局部

4、缺血模型的再血管化，缺血的肌肉組織含有自ASCs轉(zhuǎn)化的血管內(nèi)皮細(xì)胞。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的人ASCs混合脂肪顆粒移植于裸鼠皮下，促進(jìn)新生血管形成，顯著提高脂肪移植物的存活率。然而，臨床應(yīng)用自體培養(yǎng)的ASCs有其局限性，體外培養(yǎng)獲取自體ASCs顯然無法完全滿足臨床需要。體外擴增耗時長，至少需要2～3周的時間，這就意味者接受脂肪移植的患者需要二期手術(shù)。不僅如此，體外培養(yǎng)操作繁瑣，易污染，安全性低，對設(shè)施及器材要求嚴(yán)格，費用較高，

5、臨床應(yīng)用受限制。
　　既然ASCs來源于脂肪中血管基質(zhì)層細(xì)胞(stromal vascular fraction cells，SVFs)，且SVFs可通過新鮮分離獲得，那SVFs是否能替代ASCs成為促進(jìn)游離移植脂肪早期血管化的種子細(xì)胞呢？2008年，日本學(xué)者Kotaro Yoshimura第一個報道了脂肪中SVFs輔助游離脂肪移植的臨床應(yīng)用，研究證實與單純脂肪移植相比，SVFs輔助的脂肪移植能明顯降低脂肪的纖維化、液化，能顯著提

6、高脂肪移植的細(xì)胞存活率。A.van Dijk等人發(fā)現(xiàn)將SVFs靜脈注射入心肌梗死小鼠體內(nèi)，可顯著促進(jìn)缺血心肌組織的再血管化。最近還有研究指出，SVFs可通過促進(jìn)小鼠游離皮瓣再血管化來增進(jìn)皮瓣的成活。SVFs在人體脂肪組織中儲量巨大、方便獲取，自體應(yīng)用不存在免疫排斥的特性，從脂肪組織新鮮分離得到的SVFs中即含有足夠數(shù)量的、具有生物學(xué)活性的自體ASCs。更重要的是，應(yīng)用自體SVFs輔助脂肪移植，手術(shù)亦可一期完成，且無需體外培養(yǎng)，安全性高，

7、更易于臨床推廣，這使得脂肪SVFs有望成為促進(jìn)游離移植脂肪再血管化最有前景的種子細(xì)胞。
　　目前為止，盡管SVFs輔助脂肪移植技術(shù)無論在實驗室還是臨床應(yīng)用中均被證實可以有效地提高移植物的存活率。然而遺憾的是關(guān)于移植后脂肪組織存活的潛在機制尚缺乏令人信服的實驗室證據(jù)。有幾個問題有待于解決:
　　(a)SVFs輔助脂肪移植較單純脂肪移植相比脂肪細(xì)胞在移植過程中形態(tài)學(xué)發(fā)生怎樣的動態(tài)變化？
　　(b)SVFs輔助脂肪移植的脂肪

8、細(xì)胞再生的機制及SVFs中啟動移植后早期再血管化進(jìn)程的最主要因素是什么？
　　(c)SVFs輔助脂肪移植何種最佳細(xì)胞濃度才能更加促進(jìn)移植脂肪的存活率？
　　圍繞這幾個科學(xué)問題，本實驗先是研究了單純脂肪移植組織學(xué)的動態(tài)變化趨勢，通過比較新鮮分離的自體SVFs輔助脂肪移植及單純脂肪移植在不同時間點的移植效果，觀察各時間點移植物濕重測量、HE染色切片分析，免疫組化、PPARγ熒光原位雜交、Western Blot及ELISA等技術(shù)

9、來探討自體SVFs促進(jìn)脂肪移植物存活率的脂肪細(xì)胞再生及再血管化機制，這對于揭示SVF促進(jìn)游離脂肪移植存活率的具體機制，推動干細(xì)胞療法在脂肪移植中的應(yīng)用意義重大，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、單純游離脂肪移植的模型制備及脂肪移植物存活的評價。
　　將0.5ml脂肪顆粒用16號針頭，按照隨機化原則注射于實驗裸鼠腰背區(qū)皮下的2個受區(qū)，每個時間組共注射6只。分別于移植術(shù)后1天、4天、7天、14天、30天、60天

10、、90天共7個時間點，觀察以下幾個指標(biāo):
　　(1)移植物大體觀;
　　(2)濕重及濕重百分比;
　　(3)HE染色切片;
　　(4)免疫組化染色(S100，CD68)。
　　2、SVFs輔助游離脂肪移植的模型制備及脂肪移植物存活的評價。
　　將S、F兩組移植物隨機注入每只裸鼠背部皮下:S組:將數(shù)量為1×106/mlSVFs混懸液與0.3ml脂肪混合;F組將0.3mlDMEM完全培養(yǎng)基與0.3ml的脂

11、肪顆粒均勻混合（陰性對照組）。分別于移植術(shù)后1天、4天、7天、14天、30天、60天、90天共7個時間點，觀察以下幾個指標(biāo):
　　(1)移植物大體觀;
　　(2)濕重及濕重百分比;
　　(3)HE染色切片;
　　(4)免疫組化染色(S100，CD68);
　　(5)統(tǒng)計學(xué)分析。
　　3、SVFs輔助游離脂肪移植再血管化的檢測
　　分別于移植術(shù)后1天、4天、7天、14天、30天、60天、90天共7

12、個時間點，檢測S組及F組以下指標(biāo):
　　(1)HE染色切片分析;
　　(2)免疫組化染色(CD31、CD34)及系統(tǒng)軟件分析血管密度及趨勢;
　　(3)Western Blot檢測肝細(xì)胞生長因子(HGF);
　　(4)ELISA檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)血管相關(guān)因子;
　　(5)統(tǒng)計學(xué)分析。
　　4、SVFs輔助游離脂肪移植的脂肪細(xì)胞再生的檢測
　　分

13、別于移植術(shù)后1天、4天、7天、14天、30天、60天、90天共7個時間點，檢測S組及F組以下指標(biāo):
　　(1)HE染色切片分析;
　　(2)免疫組化染色(CD68、S100)及系統(tǒng)軟件分析新生脂肪細(xì)胞及成熟脂肪細(xì)胞存活率及趨勢;
　　(3)PPARγ熒光原位雜交檢測來源于人的脂肪因子的表達(dá)及分化情況;
　　(4)統(tǒng)計學(xué)分析。
　　5、SVFs輔助游離脂肪移植的最佳濃度的檢測
　　將A、B、C、D四組移

14、植物隨機注入每只裸鼠背部皮下(n=6):A組將數(shù)量約5×105/ml的SVFs混懸液，B組將數(shù)量為1×106/mlSVFs混懸液，C組將數(shù)量為2×106/mlSVFs混懸液分別與O.3ml脂肪混合;D組將0.3mlDMEM完全培養(yǎng)基與0.3ml的脂肪顆粒均勻混合（陰性對照組）。移植術(shù)后3個月取材對移植脂肪組織進(jìn)行觀察，指標(biāo)有:
　　(1)脂肪組織濕重測定;
　　(2)HE切片染色;
　　(3)Gunderson“點計數(shù)

15、”法定量評價移植物纖維壞死及脂肪細(xì)胞存活情況;
　　(4)移植物中毛細(xì)血管數(shù)目;
　　(5)統(tǒng)計學(xué)分析。
　　6.統(tǒng)計學(xué)處理
　　數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，使用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。兩組之間比較采用配對t檢驗:不同時間點的差異采用協(xié)方差分析:完全隨機設(shè)計資料的多樣本均數(shù)比較采用LSD檢驗。
　　結(jié)果：
　　1、術(shù)后不同時間點單純脂肪移植物存活率:1天（82.98±3.01）

16、％，4天（81.91±2.931）％，7天(82.27±1.74)％，14天(82.98±1.90)％，30天(48.58±3.13)％，60天(47.16±2.49)％，90天（47.52±1.74）％。移植后的脂肪在兩周內(nèi)濕重變化不顯著，14周至30天濕重顯著性減少，減少約為第一天的一半，隨后濕重減少較為緩慢，90天后濕重保持穩(wěn)定約有47％組織存活。HE觀察:移植早期組織中央部出現(xiàn)壞死形成大量空泡，脂肪細(xì)胞間隙出現(xiàn)增寬，間質(zhì)組織明顯

17、長入;第7天移出現(xiàn)了少量新生的脂肪細(xì)胞，隨后新生的脂肪細(xì)胞增多并趨向成熟，移植晚期分化成為成熟脂肪細(xì)胞且數(shù)量逐漸減少，纖維化明顯，部分區(qū)域組織結(jié)構(gòu)與正常的脂肪組織基本相同。免疫組化染色S-100蛋白陽性及小細(xì)胞CD68陰性均證實新生的小細(xì)胞是脂肪細(xì)胞。
　　2、SVFs輔助脂肪移植后濕重百分比:1天(83.33±2.49)％，4天(84.04±2.93)％，7天（84.40±2.58）％，14天（87.23±3.01）％，30天（

18、56.03±2.20）％，60天（54.61±1.74）％，90天（56.38±3.50）％，兩組采用配對t檢驗比較除第1、4、7天與對照組沒有顯著性差異外(P＞0.05)，余時間組均顯著高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。不同時間點SVFs組協(xié)方差分析示:不同天數(shù)之間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。SVFs輔助脂肪移植較對照組而言14天移植物存活率稍有抬高，30天存活率減少約為第一天的27％，90天約有56％組織存

19、活。HE觀察:早期SVFs組移植物中央?yún)^(qū)出現(xiàn)空泡、囊腔樣改變較對照組少，間質(zhì)組織長入明顯，SVFs組移植后第7天出現(xiàn)了新生的多房的脂肪細(xì)胞且較對照組多，同時伴隨成熟程度不一的多種形態(tài)的新生脂肪細(xì)胞存在，晚期分化為新生的成熟脂肪細(xì)胞較對照組多。免疫組化染色:新生細(xì)胞S-100蛋白陽性及CD68表達(dá)陰性。
　　3、①HE組織學(xué)觀察:SVFs組于移植后第4天包膜出現(xiàn)新生血管較對照組早（第7天），血管密度較對照組大，新生血管逐漸從移植物包

20、膜向中央長入。
　　②ELISA檢測不同時間點血管因子VEGF、bFGF表達(dá)量:SVFs在移植后早中期第4天、7天、14天表達(dá)量均較對照組高，且第7天達(dá)到峰值，兩組采用配對t檢驗比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，30天后的時間點表達(dá)降低，兩組沒有顯著性差異(P＞0.05);不同時間點SVFs組協(xié)方差分析示天數(shù)之間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　③Western Blot檢測不同時間點HGF血管化細(xì)胞因子:除移植后

21、第30天兩組沒有顯著性差異外，各時間點SVFs表達(dá)量均較對照組高，有顯著性差異(P＜0.05)，不同時間點SVFs組協(xié)方差分析示天數(shù)之間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　?、苊庖呓M化染色:造血干細(xì)胞系的CD34早期表達(dá)較少，第7天開始增多，14天-30天達(dá)到高峰，隨后逐漸減少，SVFs組表達(dá)高于對照組，形態(tài)上從小的間質(zhì)樣細(xì)胞分化為成熟的管腔樣血管結(jié)構(gòu)。
　?、菝庖呓M化系統(tǒng)軟件分析CD31陽性血管的密度:SVFs組第4天密

22、度緩慢增高（對照組為第7天），到30天達(dá)到高峰，隨后趨于平穩(wěn)。SVFs血管密度均高于對照組，兩組采用配對t檢驗比較于7、14、30天兩組血管密度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，余時間組無差異(P＞0.05)。不同時間點SVFs組協(xié)方差分析示天數(shù)之間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　4、①移植術(shù)后HE染色:觀察單純脂肪移植組新生脂肪細(xì)胞的動態(tài)演變過程:由原始間葉組織衍變成梭形脂肪細(xì)胞再演變成前脂肪細(xì)胞、圓形脂肪細(xì)胞、多泡性脂

23、肪細(xì)胞、單泡性印戒樣細(xì)胞、和成熟脂肪細(xì)胞。而SVFs組除了具有對照組特點外在移植早期就以不同分化狀態(tài)的多種細(xì)胞形式出現(xiàn)，且多于對照組。
　?、诿庖呓M化染色系統(tǒng)軟件分析S100陽性的成熟脂肪細(xì)胞及新生脂肪細(xì)胞不同時間點密度變化:新生脂肪細(xì)胞移植后7天開始增多，60天達(dá)到高峰，隨后密度穩(wěn)定，SVFs組高于對照組;成熟脂肪細(xì)胞于移植后密度逐漸減少，14-30天減少到最高值，60天后較為平穩(wěn)，SVFs組高于對照組。二者采用配對t檢驗比較分

24、別于14天、30天、60天兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，余時間點差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。不同時間點SVFs組協(xié)方差分析示天數(shù)之間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　?、勖庖呓M化染色CD68早期表達(dá)較少，晚期逐漸增多，集中在脂肪細(xì)胞間隙內(nèi)，新生脂肪細(xì)胞區(qū)域表達(dá)大部分陰性。
　?、躊PARγ熒光原位雜交證實新生脂肪細(xì)胞核及胞漿有點狀綠色熒光表達(dá)，證實了新生的脂肪細(xì)胞大部分是來源于人并具有分化能力，進(jìn)一步排除了

25、巨噬細(xì)胞的肯能。
　　5.不同濃度組比較:
　?、贊裰?A組(60.00±6.32)mg，B組(81.67±7.53)mg，C組(66.70±8.16)mg，D組(45.02±10.49)mg，B組脂肪存活率均高于A、C、D組(P＜0.05)，A、C兩組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　?、谘苊芏?A、C、B組血管密度均高于組D，且B組明顯高于其他三組(P＜0.05)，A、C兩組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

26、P＞0.05)。
　?、埸c計數(shù):B組存活脂肪細(xì)胞計數(shù)均高于A、C、D組(P＜0.05)，纖維組織計數(shù)均低于D組(P＜0.05)，A、C兩組之間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　討論：
　　目前，自體脂肪顆粒移植后的吸收率，國內(nèi)外的報道尚不一致，脂肪移植后的吸收率從5％～100％相差甚遠(yuǎn)，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，術(shù)后1年的吸收率約為50％。一般來說，脂肪體積在移植后的1個月內(nèi)吸收最快，2～6個月后開始趨于穩(wěn)定，1年后幾

27、乎不再吸收。近幾年，人們對脂肪移植的研究更多是關(guān)注于臨床短期或長期的移植效果及再血管化的效應(yīng)，尚缺乏一個對移植后脂肪細(xì)胞動態(tài)變化過程觀察的實驗研究。本實驗研究證實單純脂肪移植后的脂肪存活率在2周至1個月顯著性減少，3個月后基本保持穩(wěn)定。在移植早期出現(xiàn)了新生的脂肪細(xì)胞存在，隨著時間推移新生脂肪細(xì)胞增多且趨向成熟，最終以成熟脂肪細(xì)胞存活下來。
　　應(yīng)用自脂肪組織新鮮分離的SVFs復(fù)合脂肪顆粒為制備軟組織修復(fù)材料提供了一種新的方法，它較

28、ASCs而言更具有成活率高、吸收率低、使用安全、制備簡便和價格低廉的優(yōu)點，且不需要長期體外培養(yǎng)，減少了污染，可直接應(yīng)用于自體移植，能夠向成骨、成軟骨、成脂肪、成血管和神經(jīng)等方向分化，且具有明顯的促再血管化及提高移植物存活率效應(yīng)。為了證實SVFs復(fù)合脂肪移植與單純脂肪移植相比在形態(tài)學(xué)及組織學(xué)動態(tài)演變過程中的差別，本實驗比較了不同時間點兩組的大體觀及組織學(xué)并證實了SVFs輔助脂肪移植比單純脂肪移植更能提高脂肪移植的存活率，明顯降低脂肪的纖維

29、化、液化，早期出現(xiàn)了較單純脂肪組而言更多的新生多房脂肪細(xì)胞，并伴隨成熟程度不一的多種形態(tài)的新生脂肪細(xì)胞存在，揭示了脂肪移植物脂肪細(xì)胞再生的潛在機制。
　　正如眾所周知，臨床上進(jìn)行任何移植都必須考慮到血液供應(yīng)，移植物只有獲得了充分的血供才能生存。但早期細(xì)胞的營養(yǎng)還主要依靠細(xì)胞間液的滲透，但這種滲透也最多能營養(yǎng)到距離毛細(xì)血管150μm的脂肪細(xì)胞，而超過這個距離的細(xì)胞無法獲得支持細(xì)胞代謝所必須的營養(yǎng)。這也解釋了為何單純脂肪細(xì)胞游離移植存

30、活率不高的原因。因此如何能快速重建良好的血運，是脂肪移植成功與否的關(guān)鍵。SVFs所具有的促血管化作用便體現(xiàn)出了極大的應(yīng)用潛力，但是SVFs通過何種機制來促進(jìn)游離脂肪移植后血運重建目前仍不清楚。本實驗證實了SVFs輔助脂肪移植的再血管化最早發(fā)生于移植后的第4天，較單純脂肪移植要早，血管密度較單純脂肪組多。SVFs組早期VEGF、HGF和bFGF血管相關(guān)因子的表達(dá)均較單純脂肪組高，這說明SVFs在移植的早期處于缺氧狀態(tài)下，通過旁分泌機制有效

31、的分泌促血管因子，從而加速新生血管從移植物的周圍受區(qū)以“出芽”方式形成，提高了移植物的存活率。
　　自體脂肪移植的最大挑戰(zhàn)在于維持其長久的效果，因此對于脂肪移植后脂肪細(xì)胞到底是以何種方式存活下來的探討成為研究的熱點，關(guān)于單純游離移植脂肪的存活機制，存在兩種學(xué)術(shù)觀點:一種是宿主取代論，即宿主的巨噬細(xì)胞吞噬壞死脂肪細(xì)胞釋放的脂滴后，變?yōu)槌墒熘炯?xì)胞，取代原有的移植細(xì)胞;一種為細(xì)胞存活論，即宿主的巨噬細(xì)胞只是清除部分壞死脂肪細(xì)胞釋放的脂

32、滴，并不能形成脂肪細(xì)胞取代移植的脂肪組織，部分宿主原有的脂肪細(xì)胞度過最初的缺血缺氧期后，長期存活下來。本實驗證實了SVFs脂肪移植比單純脂肪組更能促進(jìn)脂肪細(xì)胞細(xì)胞的再生。成熟脂肪細(xì)胞及新生的脂肪細(xì)胞存活率均高于對照組。單純脂肪移植新生脂肪細(xì)胞動態(tài)演變過程是由梭形脂肪細(xì)胞再演變成圓形脂肪細(xì)胞、單泡性印戒樣細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞。而SVFs組則是以不同分化狀態(tài)的細(xì)胞存活，新生的脂肪細(xì)胞大部分是來源于人SVFs中的間質(zhì)細(xì)胞分化及去分化脂肪細(xì)胞的再

33、分化，少部分是由原有的脂肪細(xì)胞成脂再分化而來，揭示了脂肪細(xì)胞再生的潛在機制。
　　國外的研究者提出在SVFs輔助脂肪移植中通常采用的SVFs與脂肪顆粒的體積比是1∶1，即可取得較為理想的脂肪移植效果，但按1∶1體積比進(jìn)行移植并不客觀準(zhǔn)確，且膠原消化過程過于繁瑣，因此如何客觀準(zhǔn)確的評估移植比例，對于脂肪移植是至關(guān)重要的。有研究稱每克皮下脂肪大約可獲取0.5×106～2.0×106個有活力的SVFs。在我們的研究中已證實1ml人脂肪組

34、織中可提取出0.9×106～3.0×106個SVFs，故單位體積的待移植脂肪可混合更多數(shù)量的SVFs。我們認(rèn)為SVFs的濃度是影響移植效果的重要原因之一，利用濃度比進(jìn)行移植更為精確和客觀，而今關(guān)于SVFs輔助脂肪移植的有效濃度尚缺乏準(zhǔn)確性的報道，如果加入血管基質(zhì)成分過多，會使得術(shù)后脂肪組織的體積無法預(yù)測;反之如果加入血管基質(zhì)成分太少，移植脂肪組織的體積達(dá)不到預(yù)期效果。故本實驗中研究促進(jìn)脂肪移植的最佳SVFs濃度，發(fā)現(xiàn)1×106/ml的S

35、VFs濃度更能促進(jìn)移植脂肪組織存活率及新生血管生成，為臨床軟組織缺損修復(fù)提供了實驗依據(jù)。
　　結(jié)論：
　　1、從單純脂肪及SVFs輔助脂肪移植后到脂肪成活的整個過程中存在著脂肪細(xì)胞動態(tài)變化的規(guī)律，移植物體積的變化伴隨著組織學(xué)的變化。
　　2、SVFs輔助脂肪移植比單純脂肪移植更能提高脂肪移植再血管化及脂肪細(xì)胞再生效果，更能提高移植物的存活率。
　　3、SVFs輔助脂肪移植的再血管化發(fā)生較單純脂肪移植早，自體SVF