負(fù)壓吸引誘導(dǎo)游離移植后脂肪再生的機制研究.pdf

1、脂肪移植的應(yīng)用至今已有百余年的歷史，具有來源廣泛，取材簡便，低免疫原性等優(yōu)點，目前被認(rèn)為是整形外科治療軟組織缺損最常用的手術(shù)方法。脂肪移植效果雖然明顯，但移植后脂肪常出現(xiàn)吸收、硬結(jié)、囊腫、鈣化等問題，使得脂肪長期保留率為20-70％。對移植后脂肪最終保留體積的不預(yù)測性限制了其在臨床上的應(yīng)用。
　　軟組織外擴張技術(shù)的基本原理是提供負(fù)壓吸引力。目前其臨床效果已被證實，但是相關(guān)實驗研究非常少。現(xiàn)階段幾乎所有的動物實驗研究的是在脂肪移植術(shù)

2、前應(yīng)用負(fù)壓吸引，強調(diào)了對受區(qū)的預(yù)擴張能顯著增加受區(qū)細(xì)胞增殖，促進(jìn)新生血管的形成及脂肪細(xì)胞的存活，從而提高移植后脂肪的保留率。關(guān)于脂肪移植術(shù)前進(jìn)行受區(qū)預(yù)擴張，提高保留率的研究已較為深入，有幾個問題亟待解決:(a)如何建立一個穩(wěn)定且有效的負(fù)壓吸引輔助脂肪移植的模型？(b)負(fù)壓吸引輔助脂肪移植相較單純游離脂肪移植，隨著移植時間的延長，移植物內(nèi)再生相關(guān)細(xì)胞（血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞）來源及數(shù)量發(fā)生怎樣的動態(tài)變化？(c)負(fù)壓吸引輔

3、助脂肪移植最終形成的構(gòu)建物中新生脂肪細(xì)胞的來源及形態(tài)學(xué)變化如何？(d)從分子層面分析，負(fù)壓吸引對與脂肪再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)產(chǎn)生怎樣的影響？
　　本實驗?zāi)M臨床上應(yīng)用的軟組織外擴張系統(tǒng)，設(shè)計并建立了一改良裝置用以提供三維機械力。我們的實驗動物模型結(jié)合了兩個以往的模型:負(fù)壓吸引模型及脂肪互換移植模型，并提供穩(wěn)定的外負(fù)壓吸引力。利用磁共振成像技術(shù)對比觀察負(fù)壓吸引作用下的游離移植的脂肪組織與單純移植的脂肪組織的形態(tài)學(xué)變化。利用HE染色

4、分析，免疫熒光及Western blot等實驗技術(shù)觀察不同時間點移植物的濕重，組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞的動態(tài)變化，從而對比兩組的移植效果。本實驗的研究目的是探討負(fù)壓吸引誘導(dǎo)移植后脂肪再生的作用機制，該研究結(jié)果為脂肪移植的臨床應(yīng)用提供重要的實驗依據(jù)，對指導(dǎo)軟組織外擴張技術(shù)輔助脂肪移植在臨床上的應(yīng)用有著重大的意義。
　　目的：
　　1.對比分析負(fù)壓吸引輔助游離脂肪移植較單純游離脂肪移植，再生相關(guān)細(xì)胞的動態(tài)變化
　　2.負(fù)壓吸引作用下

5、，移植物中新生的成熟脂肪細(xì)胞的來源及形態(tài)學(xué)變化
　　3.對比分析與再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisomeproliferator-activated receptor, PPARγ)蛋白的表達(dá)
　　4.探索軟組織外擴張?zhí)峁┑呢?fù)壓吸引誘導(dǎo)移植后脂肪再生可能的機制
　　方法：
　　1.動物模型的建立
　　實驗中所需動物的來源:8周雄性C57BL/6小鼠及C57BL/6-Tg(CAG

6、-EGFP)mice（green fluorescent protein/GFP小鼠）分別來自南方醫(yī)科大學(xué)動物研究所及南京大學(xué)模式動物研究所。本實驗研究中建立的負(fù)壓吸引輔助脂肪移植的動物模型結(jié)合了負(fù)壓吸引模型及脂肪互換移植模型，方法如下:
　　1.1 脂肪互換移植模型
　　首先用戊巴比妥鈉小鼠腹腔內(nèi)注射麻醉(50 mg/kg)，將8周的雄性C57BL/6小鼠腹股溝處的毛發(fā)剪短并用棉球蘸取脫毛膏，在所需部位脫毛。分離并切取皮下

7、腹股溝脂肪瓣，約150-200mg，輕柔地切成小的顆粒狀，其大小與臨床上抽吸的脂肪組織類似。然后用攜帶14G鈍針的1ml注射器，將GFP陰性即C57BL/6小鼠的腹股溝脂肪組織注射到GFP小鼠的背部皮下組織下。用此方法處理55只GFP小鼠，并將移植了脂肪組織的GFP小鼠隨機分為兩組，實驗組為游離脂肪移植+負(fù)壓吸引，對照組為單純游離脂肪移植。所有的小鼠頸部脫臼處死，在移植后的0、1、2、4、8、12周獲取移植脂肪進(jìn)行后續(xù)觀察，每個時間點的

8、樣本量為5只。
　　1.2 負(fù)壓吸引模型
　　負(fù)壓吸引裝置是由三個部分組成，即負(fù)壓泵，連接裝置，動物固定器。負(fù)壓泵為低負(fù)壓羊水吸引器（型號:DYX-1A;負(fù)壓調(diào)節(jié)范圍:-20-0kpa;生產(chǎn)商:上海斯曼峰公司）。連接器由白色透明橡膠管組成，一端連接負(fù)壓吸引器，另一端連接一3D打印獲得的穹窿狀裝置，該裝置為無毒的光敏樹脂材料，直徑為1.5cm，容積為1.5ml。固定器為圓筒狀裝置，大小比小鼠直徑略大，裝置頂部為5×2cm大小的

9、矩形窗口，用于連接穹窿狀裝置。實驗中負(fù)壓大小的設(shè)置為-3kpa（約-23 mmHg），該負(fù)壓值的選擇為臨床上使用Bmva的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)的低值，并經(jīng)過了多次預(yù)實驗摸索。本實驗中實驗組小鼠脂肪移植后在固定時間段進(jìn)行負(fù)壓吸引處理，每天10小時，持續(xù)4周后停止負(fù)壓吸引，與臨床上使用方法一致。兩組小鼠觀察至12周，并在上述的各個時間點取材。樣本放置在4％多聚甲醛中固定24小時，脫水并石蠟包埋。
　　2.磁共振（magnetic resonan

10、ce imaging, MRI）對比觀察移植后脂肪組織的形態(tài)學(xué)變化
　　利用磁共振技術(shù)掃描負(fù)壓吸引作用下小鼠背部移植脂肪區(qū)域，掃描儀為Philips Achieva3.0T，用戊巴比妥鈉小鼠腹腔內(nèi)注射麻醉(50 mg/kg)，整個過程小鼠保溫，獲得小鼠背部移植脂肪區(qū)域的薄層T1及T2加權(quán)像圖片，觀察移植后脂肪組織的固定情況。
　　3.大體及組織學(xué)觀察
　　用數(shù)碼相機捕捉并顯示每個時間點的大體圖片，將樣本制成蠟塊后連續(xù)切

11、片，厚度為5μ m，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行HE染色，染色結(jié)果用奧林巴斯BX51顯微鏡觀察，并用奧林巴斯DP71數(shù)碼相機拍照。通過對每張切片10個視野中血管數(shù)量的計算評估移植物中血管新生(40×)，所有數(shù)據(jù)的采集及分析均由兩位觀察者獨立地雙盲進(jìn)行。
　　4.免疫熒光觀察移植物中再生相關(guān)細(xì)胞的動態(tài)變化
　　樣本切成5μm的石蠟薄片后進(jìn)行免疫熒光染色。免疫熒光使用的一抗如下:雞抗GFP（稀釋比例為1∶200;英國劍橋Abcam公司），大

12、鼠抗小鼠CD34（稀釋比例為1∶300; Abcam公司），豚鼠抗小鼠（稀釋比例為1∶400;德國海德堡progen公司），大鼠抗小鼠F4/80（稀釋比例為1∶25; Abcam公司）。使用的二抗如下:Alexa Fluor488-conjugated山羊抗雞免疫球蛋白Y（稀釋比例為1∶200;澳大利亞Thermo Fisher公司），Alexa Fluor555-conjugated驢抗大鼠免疫球蛋白G（稀釋比例為1∶200; Abc

13、am公司），Alexa Fluor647-conjugated山羊抗豚鼠免疫球蛋白G（稀釋比例為1∶200; Abcam公司）。細(xì)胞核染色用DAPI（稀釋比例為1∶200;美國Sigma公司）新生微血管染色用Lectin594（稀釋比例為1∶200，美國Invitrogen公司）。每張切片至少選取3個視野計算新生微血管數(shù)量。
　　5.用Western blot技術(shù)檢測移植物中成脂分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子(PPARγ蛋白)的表達(dá)

14、r>　　為了從分子層面觀察脂肪成脂分化過程，本研究利用Western blot技術(shù)半定量分析過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)，它是脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，該蛋白的表達(dá)量代表成脂分化程度。一抗為兔抗小鼠PPARγ（稀釋比例為1∶500; Abcam），二抗為山羊抗兔免疫球蛋白G（稀釋比例為1∶800，上海生工生物工程有限公司）。另外，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體（稀釋比例為1∶5000; Bi

15、oworld技術(shù)股份有限公司）作為內(nèi)參。
　　6.統(tǒng)計學(xué)分析
　　所有的數(shù)據(jù)應(yīng)用IBM SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，最初實驗動物的體重值雖在一定范圍內(nèi)，因無法人為控制，為了排除小鼠體重對實驗結(jié)果的影響，本實驗將小鼠的體重作為協(xié)變量，采用帶協(xié)方差的析因分析方法。小鼠的體重及移植物的標(biāo)準(zhǔn)化重量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（mean±S.E）。其他數(shù)據(jù)用均數(shù)±方差表示（mean±SD），各個時間點兩組的比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.

16、05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.磁共振證實移植物為脂肪組織且在負(fù)壓吸引作用下固定良好，肉眼觀察脂肪組織周圍有較多的膠凍狀滲出液。
　　2.移植后1、4、8、12周，負(fù)壓吸引作用下移植物標(biāo)準(zhǔn)化重量較單純性脂肪移植顯著提高。移植后12周，實驗組及對照組移植物標(biāo)準(zhǔn)化重量分別為0.060±0.001,0.046±0.001。
　　3.在負(fù)壓吸引作用下，巨噬細(xì)胞大量滲入移植物內(nèi)，另外，新生微血管數(shù)量增加，

17、移植物內(nèi)血供增加，并且細(xì)胞主要來源于宿主。
　　4.在負(fù)壓吸引作用下，主要再生細(xì)胞來源的CD34+間充質(zhì)干細(xì)胞由宿主向移植物內(nèi)遷移的數(shù)量增多。
　　5.移植后第12周，負(fù)壓吸引作用下的移植物中再生的成熟脂肪細(xì)胞一半來源于宿主，一半來源于移植物。
　　6.移植后第14天及28天，負(fù)壓吸引輔助脂肪移植較單純性脂肪移植，移植物中的PPARγ蛋白的表達(dá)顯著增加。
　　結(jié)論：
　　1.本研究通過對負(fù)壓吸引輔助游離脂肪