1,6-二磷酸果糖在游離脂肪移植中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、近年來，自體脂肪移植術(shù)(autologous fat transplantation，AFT)被越來越多的應(yīng)用于治療軟組織缺損相關(guān)疾病和美容整形手術(shù)等，逐漸受到人們的關(guān)注。然而，移植后組織成活率低、吸收率高的缺陷限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用。目前，主流觀點(diǎn)認(rèn)為導(dǎo)致移植后脂肪組織吸收的原因可能與營養(yǎng)物質(zhì)缺乏和氧氣供應(yīng)不足有關(guān)。為了解決這一問題，臨床大夫和科研人員采取了多種方法，基本可以概括為:應(yīng)用各種生長因子，應(yīng)用干細(xì)胞，以及應(yīng)用藥物三種策略

2、，但現(xiàn)有研究都沒有得到確切、持久、且良好的臨床效果。
　　1，6-二磷酸果糖(Fructose1，6-bisphosphate，F(xiàn)BP)因?qū)μ幱谌毖毖醐h(huán)境中的組織器官具有良好的保護(hù)作用，而被廣泛的應(yīng)用于器官移植、心肌缺血、腦組織梗死、創(chuàng)傷急救等研究及臨床實(shí)踐中。FBP能夠減少心肌或者腎臟梗死區(qū)域細(xì)胞發(fā)生凋亡壞死的數(shù)量，降低無菌性炎癥的程度，幫助其度過危險(xiǎn)期。那么，在脂肪移植中，F(xiàn)BP是否能發(fā)揮同樣的作用，減少脂肪移植物中細(xì)胞的凋

3、亡壞死或者促進(jìn)游離脂肪移植物的存活，目前還未見相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究，首先明確FBP在促進(jìn)脂肪移植存活中的作用，隨后探討了其有效的應(yīng)用時(shí)間窗等問題，并進(jìn)一步從臨床角度出發(fā)，摸索其可能作用的目的細(xì)胞和具體機(jī)制。
　　目的:
　　1.明確游離脂肪移植后，移植物的動(dòng)態(tài)演變過程。
　　2.明確FBP是否對(duì)游離脂肪移植物有保護(hù)作用，提高脂肪移植效果。
　　3.探討FBP發(fā)揮作用的目的細(xì)胞及具體機(jī)制。
　　方法與結(jié)

4、果:
　　1.游離脂肪移植后，移植物的動(dòng)態(tài)演變過程:
　　方法:脂肪抽吸術(shù)獲得人脂肪顆粒(n=3)，注射入BALB/c裸鼠(n=3)背部皮下脊柱兩側(cè)并于術(shù)后2/8/12周取材，分別通過共聚焦顯微鏡掃描，大體觀察，體積測(cè)量，稱重，HE染色等方法，明確脂肪顆粒大小，移植物的重量、體積、及組織學(xué)變化。
　　結(jié)果:
　?、偻ㄟ^共聚焦顯微鏡檢測(cè)可見抽吸所得脂肪顆粒直徑在1500um-5000um區(qū)間。
　?、谥绢w粒

5、與完整組織相比，未見明顯血管結(jié)構(gòu)存在，且顆粒內(nèi)可見顯著的破損脂肪細(xì)胞存在。
　?、壑疽浦参镫S著時(shí)間的推移，色澤由金黃色逐漸變?yōu)榘底厣?，體積逐漸減小，重量逐漸減輕。包膜在移植后2周形成且一直持續(xù)到12周。新生的血管和幼稚脂肪細(xì)胞隨著包膜出現(xiàn)，并伴隨纖維間隔的長入。位于移植物外圍區(qū)域的脂肪細(xì)胞始終保持較好的形態(tài)和完整性，而位于移植物中心區(qū)域的大部分脂肪細(xì)胞在術(shù)后第2周就已經(jīng)壞死，形成多個(gè)空腔。
　　2.FBP在游離脂肪移植中的

6、作用:
　　方法:脂肪移植術(shù)前2小時(shí)內(nèi)注射不同濃度的FBP進(jìn)行預(yù)處理，術(shù)后連續(xù)六天腹腔注射給藥。實(shí)驗(yàn)分為4mg/g（每單位小鼠體重所用藥物質(zhì)量）、2.5mg/g、1mg/g、0.5mg/g FBP應(yīng)用組和對(duì)照組（每組裸鼠為8-12只）。術(shù)后2/8/12周分別對(duì)移植物稱重，測(cè)量長寬高，利用組織學(xué)、酶活性檢測(cè)、以及Real-Time PCR等方法對(duì)移植物的重量、體積、完整細(xì)胞保有情況、存活細(xì)胞活性、以及脂肪細(xì)胞和血管新生情況進(jìn)行評(píng)估。

7、
　　結(jié)果:
　?、俑鹘M脂肪移植物均隨時(shí)間延長，呈現(xiàn)體積減小、重量減輕的趨勢(shì);在第12周，4mg/g用藥組的移植物體積和重量保留均優(yōu)于對(duì)照組。
　?、诩?xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示移植物邊緣區(qū)域的完整細(xì)胞數(shù)量在術(shù)后第2周及第12周高濃度用藥組多于對(duì)照組，中心區(qū)域兩者之間的區(qū)別則呈現(xiàn)出一個(gè)從有到無的變化。移植后第2周和第12周，4mg/g組的存活脂肪細(xì)胞數(shù)量均多余對(duì)照組，且2周時(shí)4mg/g用藥組組織水平PPARr表達(dá)量更高。酶活性檢測(cè)

8、顯示高濃度給藥組存活的脂肪細(xì)胞活性在第2周時(shí)明顯優(yōu)于對(duì)照組，且一直持續(xù)到第12周。術(shù)后5天實(shí)驗(yàn)組存活脂肪細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組。
　?、坌律軘?shù)量在第2周時(shí)4mg/g與2.5mg/g用藥組與對(duì)照組有顯著性差異，同時(shí)，血管形成相關(guān)基因VEGF的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，但到第12周時(shí)兩者之間新生血管數(shù)量沒有顯著差異。
　　3.FBP在游離脂肪移植中的作用機(jī)制探索:
　　方法:我們從缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、和炎癥三個(gè)方面，

9、探討FBP改善游離脂肪移植效果的可能機(jī)制。通過Real-time PCR和免疫熒光檢測(cè)，明確移植物炎癥狀態(tài)。通過控制氧氣張力和營養(yǎng)成分明確氧氣剝奪或者營養(yǎng)剝奪兩種因素對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(n=3)和成熟脂肪細(xì)胞(n=3)的影響，并通過添加FBP后的改善情況，明確FBP在改善缺氧和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏中的作用。進(jìn)而，通過飽和脂肪酸刺激實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FBP是否能夠降低成熟脂肪細(xì)胞的炎癥因子及炎癥受體的表達(dá)水平，明確其在改善炎癥方面的作用。具體FBP應(yīng)用分組

10、情況為:2mmol/L、1mmol/L、0.5mol/L FBP應(yīng)用組和對(duì)照組。
　　結(jié)果:
　?、僦疽浦残g(shù)后5天，4mg/g用藥組的炎癥因子TNFa的表達(dá)水平與對(duì)照組出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且組織內(nèi)巨噬細(xì)胞侵蝕情況較輕;其他炎癥相關(guān)指標(biāo)也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì);術(shù)后2周差異消失。
　?、?mmol/L FBP存在時(shí)，hASCs在氧氣張力正常和無血清培養(yǎng)條件下增殖能力與對(duì)照組相比出現(xiàn)了顯著區(qū)別，實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞數(shù)目明顯多于無血清且無藥

11、物組;氧氣張力正常而有血清存在時(shí)則無此現(xiàn)象;0.5mmol/L FBP存在且培養(yǎng)環(huán)境中氧氣和血清缺乏時(shí)，hASCs的增殖能力也表現(xiàn)一定的優(yōu)勢(shì);0.5mmol/L FBP存在且缺乏氧氣而有血清時(shí)，hASCs的增殖能力有明顯優(yōu)勢(shì);低氧張力且無血清處理12小時(shí)，三組細(xì)胞之間也顯示出了類似的趨勢(shì);對(duì)NF-kB和Caspase8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)無論處理12或24小時(shí)，組與組之間并沒有表現(xiàn)出顯著差異;對(duì)TLR4與IL-1B進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)氧分壓正常且無血清時(shí)

12、，加入0.5mmol/L和1mmol/L的FBP均能在一定程度上放緩兩者的上升趨勢(shì)。
　?、塾靡陨戏椒ㄌ幚沓墒熘炯?xì)胞，細(xì)胞凋亡水平并沒有表現(xiàn)出顯著區(qū)別;活/死細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)出與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞類似的趨勢(shì);低氧張力且有血清時(shí)，1mmol/L的FBP能夠增加脂肪細(xì)胞PPARr的表達(dá)水平。在常氧張力且無血清時(shí)，1mmol/L的FBP能夠增加脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用。培養(yǎng)幾種加入FBP時(shí)用500umol/L的棕櫚酸鈉刺激脂肪細(xì)胞后，IL-1

13、β的表達(dá)水平較低。
　　結(jié)論:
　　1.臨床吸取的游離脂肪標(biāo)本呈不規(guī)則的顆粒狀，直徑介于1500um-5000um之間;移植后，脂肪組織內(nèi)的細(xì)胞由2周的凋亡壞死，發(fā)展至8周時(shí)部分再生重建，直到第12周移植組織基本穩(wěn)定，呈現(xiàn)出一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程。
　　2.應(yīng)用4mg/g FBP能夠較好的保留脂肪組織的體積、重量，同時(shí)促進(jìn)移植物內(nèi)保留更多完整的脂肪細(xì)胞，并且促進(jìn)血管的生成;應(yīng)用4mg/g FBP還能夠保護(hù)移植物內(nèi)脂肪細(xì)胞糖

14、脂代謝的關(guān)鍵酶類免受缺血缺氧的影響;FBP呈現(xiàn)出一個(gè)對(duì)脂肪移植物多方位和動(dòng)態(tài)的保護(hù)過程。
　　3.FBP能夠降低移植組織的TNFa以及IL-1β等炎癥因子的水平，同時(shí)下調(diào)炎癥通路中重要受體Toll-like receptor4的表達(dá)水平;特定濃度的FBP能夠在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡壞死、細(xì)胞炎癥因子和炎癥受體表達(dá)水平、以及細(xì)胞葡萄糖利用能力等方面產(chǎn)生廣泛影響，最終作用是使處于不良環(huán)境中的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞保持良好的增殖能力，減少脂肪間充