促進(jìn)游離移植組織再血管化之細(xì)胞療法的種子細(xì)胞來源探討.pdf

1、研究背景：游離組織移植是整形與修復(fù)重建外科的基本技術(shù)，游離的組織移植到受區(qū)以后，其血液供應(yīng)是成活的基礎(chǔ)。早期的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)主要依賴供體周圍組織液的血漿營(yíng)養(yǎng)，但這種營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)是有限的，不能保證供體的長(zhǎng)期存活，僅能幫助其渡過早期的缺血缺氧狀態(tài)；移植48小時(shí)后，供體組織開始與受區(qū)血管床建立新的血液循環(huán)，此再血管化過程是游離移植能否成功的決定因素，再血管化不及時(shí)或不充分都會(huì)導(dǎo)致供體組織發(fā)生壞死。因此探索促進(jìn)游離移植組織再血管化的手段，是整形外科技術(shù)發(fā)

2、展的迫切需要，特別是在游離脂肪移植領(lǐng)域，如能解決移植后的血供問題，就能突破游離脂肪移植在臨床應(yīng)用中的瓶頸問題——中心性壞死、吸收和纖維化。 細(xì)胞療法是指應(yīng)用自體、異體或同種異體的細(xì)胞，經(jīng)體外操作后回輸(或植入)人體，以達(dá)到治療、診斷或預(yù)防作用的目的。細(xì)胞療法最初和最成功的范例是輸血和骨髓、造血干細(xì)胞移植。近年來，隨著人們對(duì)干細(xì)胞研究的不斷深入，細(xì)胞療法的治療領(lǐng)域不斷拓寬，延伸到了腫瘤的生物治療、免疫治療，糖尿病、冠心病的治療等領(lǐng)

3、域。細(xì)胞療法也能有效地促進(jìn)血管生成和創(chuàng)面愈合，保護(hù)缺血缺氧組織。到目前為止，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞都有確實(shí)的促進(jìn)組織再血管化作用的證據(jù)。 然而，要滿足實(shí)際應(yīng)用的需要，細(xì)胞療法的種子細(xì)胞除了需有明確的治療作用外，還要滿足來源充足、易于采集、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)等條件。綜合這些考慮，內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)和脂肪干細(xì)胞(Adipose—Derived Stem Cel

4、ls，ASCs)是比較好的兩個(gè)選擇。EPCs被認(rèn)為是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體，它來源于骨髓，能從外周血中分離獲得，病理應(yīng)激狀態(tài)下能富集到缺血損傷部位，參與新血管的生成。所以從理論上說，它是促進(jìn)移植物再血管化的理想種子細(xì)胞。但EPCs的體外增殖能力不強(qiáng)且外周血中含量很少，是它作為種子細(xì)胞來源的缺點(diǎn)，使用培養(yǎng)晚期出現(xiàn)的晚期EPC有望彌補(bǔ)這個(gè)缺陷。ASCs能從脂肪組織中大量獲得，是一具有多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有來源充足、易于采集、體外擴(kuò)增能

5、力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。ASCs也具有促血管化作用，能在缺血部位分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞參與血管新生，還能分泌促進(jìn)血管新生的多種細(xì)胞因子。鑒于細(xì)胞間相互作用的重要性，我們?cè)O(shè)想將EPCs與ASCs混合，可能利用ASCs促進(jìn)EPCs的增殖，并利用EPCs誘導(dǎo)ASCs向內(nèi)皮方向分化，使二者的組合成為促血管化種子細(xì)胞的“黃金搭檔”。目的：探索如何獲取采集方便、來源充足、易于擴(kuò)增的促血管化種子細(xì)胞，以應(yīng)用于細(xì)胞療法，促進(jìn)游離移植組織的再血管化。 方法：1、

6、分離培養(yǎng)成人外周血來源EPCs采集健康成人肘靜脈血，PBS等倍稀釋后，疊加到Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上，離心后小心吸取中間單個(gè)核細(xì)胞層，M199培養(yǎng)基洗滌兩次，重懸于含有20％胎牛血清、10ng/ml VEGF的M199培養(yǎng)基中，接種于人纖維連接蛋白(humanfibronectin，hFN)包被過的6孔板中，置飽和濕度、5％CO<,2>、37℃孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)，第4天首次換液，此后每2至3天酌情換液。 2、觀察成人外周血來源

7、：EPCs在體外培養(yǎng)過程當(dāng)中的細(xì)胞生物學(xué)特性演變每日對(duì)EPCs進(jìn)行大體形態(tài)觀察并攝像，分別于第7日及第21日，將EPCs用0.25％胰蛋白酶消化下來，行CDllc、CD14、CD31、CD34、CD44、CD45、CD133、vwF、flk-1的流式細(xì)胞學(xué)分析。 將EPCs接種在hFN包被過的蓋玻片上，于第7天時(shí)取出，固定后行vWF，CD31，CD34的免疫組化染色檢查。將培養(yǎng)至第21天的EPCs消化下來，制作細(xì)胞爬片，行vWF

8、免疫組化染色檢查。 3、分離培養(yǎng)人ASCs人ASCs由南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院整形外科朱茗碩士惠贈(zèng)，以普通高糖DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)，每3至5天傳一代。 4、成人外周血來源EPCs與人ASCs的混合培養(yǎng)將第5代的ASCs消化下來，重懸于M199完全培養(yǎng)基中，在EPCs首次換液時(shí)(第4天)接種于長(zhǎng)有EPCs的培養(yǎng)板中，同一板上不加的孔為對(duì)照，24小時(shí)后首次換液，之后換液方法同EPCs，的方法。 5、AS

9、Cs向內(nèi)皮細(xì)胞方向的誘導(dǎo)培養(yǎng)從脂肪抽吸物中分離出ASCs，分離出來后分為兩部分，一部分使用EPC的完全培養(yǎng)基(M199+VEGF lOng/ml+20％FCS)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，一部分用普通DMEM高糖培養(yǎng)液進(jìn)行正常傳代培養(yǎng)，作為陰性對(duì)照。1月后分別對(duì)誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的ASCs行CD29、CD31和CD45的流式細(xì)胞學(xué)分析。 結(jié)果與討論：1、外周血來源單個(gè)核細(xì)胞接種后約有1/20貼壁。第4天左右可形成從中心向外放射的典型EPC集落，第7

10、天有大量長(zhǎng)梭形、雙極針樣細(xì)胞生長(zhǎng)，流式細(xì)胞學(xué)分析顯示它表達(dá)CD11c、CD14、CD44，弱表達(dá)CD31、flk-1、vWF，不表達(dá)CD34、CD133。免疫組化染色結(jié)果顯示：CD31表達(dá)陽性，vWF表達(dá)弱陽性，CD34表達(dá)陰性。說明培養(yǎng)第7天的外周血來源單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)單核巨噬細(xì)胞系相關(guān)抗原陽性，表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞系相關(guān)抗原弱陽性，表達(dá)造血細(xì)胞系相關(guān)抗原陰性，符合內(nèi)皮祖細(xì)胞的表型特征，且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持EPCs與單核細(xì)胞同源的學(xué)說。 2

11、、將上述細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，第7-10天左右長(zhǎng)梭形細(xì)胞開始減少，同時(shí)出現(xiàn)大量橢圓形細(xì)胞，呈內(nèi)皮細(xì)胞典型的鵝卵石樣，符合晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞的形態(tài)。第3 周時(shí)長(zhǎng)梭形細(xì)胞已基本消失，而橢圓形細(xì)胞增殖旺盛。流式細(xì)胞分析顯示培養(yǎng)第2l天的細(xì)胞表達(dá)CD31、vWF明顯增加，而CD44的表達(dá)明顯下降，CD34的表達(dá)仍為陰性。培養(yǎng)至第21天的細(xì)胞爬片行vWF因子免疫組化染色顯示為陽性。說明原代培養(yǎng)晚期(第2周以后)能出現(xiàn)更符合內(nèi)皮細(xì)胞特征的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞(1at

12、e EPC)，與培養(yǎng)早期(第4～7天)出現(xiàn)的早期EPC(early EPC)相比，其內(nèi)皮細(xì)胞系相關(guān)抗原的表達(dá)增強(qiáng)，而單核巨噬細(xì)胞系相關(guān)抗原的表達(dá)減弱。3、ASCs與原代EPCs共同培養(yǎng)第2天，可見共同培養(yǎng)組的EPCs較對(duì)照組的更為伸展，細(xì)胞數(shù)目也更多；第3天仍可見相同現(xiàn)象。說明ASCs與EPCs共同培養(yǎng)時(shí)，能促進(jìn)EPCs的增殖分化。 4、ASCs在EPCs的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)1月后，流式細(xì)胞學(xué)分析顯示其CD31表達(dá)明顯上調(diào)，CD2

13、9的波形變?yōu)殡p峰狀。說明此時(shí)細(xì)胞成分已發(fā)生了改變，出現(xiàn)了高表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)抗原CD31的細(xì)胞群。 小結(jié)：1、本實(shí)驗(yàn)從成人外周血中成功分離培養(yǎng)出了EPCs，并證實(shí)其表達(dá)單核巨噬細(xì)胞系相關(guān)抗原，但不表達(dá)造血細(xì)胞相關(guān)抗原，為EPCs表面標(biāo)志的鑒定提供了新的證據(jù)。 2、在國(guó)內(nèi)首先對(duì)EPCs在體外培養(yǎng)過程中的變化作了觀察，并從成人外周血中分離培養(yǎng)出了增殖能力較強(qiáng)，在細(xì)胞療法領(lǐng)域具有更大實(shí)用價(jià)值的晚期EPC。 3、在國(guó)內(nèi)外首