ASCs復(fù)合PRF促進(jìn)自體移植脂肪血管化的實驗研究.pdf

1、【背景】
　　由于各種先天性畸形、創(chuàng)傷、腫瘤切除術(shù)等原因造成的軟組織缺損，是目前臨床上修復(fù)治療的一大難題之一。患者自體的脂肪組織具有來源充足、取材方便且無任何免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點，目前被認(rèn)為是修復(fù)各種軟組織缺損的比較好的自體填充材料。但目前常用的自體脂肪移植方法常導(dǎo)致移植脂肪出現(xiàn)一些吸收、萎縮、液化或壞死，充填的組織量難以精確掌握等缺點而嚴(yán)重影響修復(fù)效果，給廣大患者和醫(yī)生帶來極大的困擾。隨著各種研究技術(shù)的不斷發(fā)展，脂肪移植技術(shù)有了進(jìn)

2、一步的發(fā)展。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)以來源于脂肪組織的血管基質(zhì)成分復(fù)合自體的富血小板纖維蛋白進(jìn)行的脂肪移植，較顯著地提高了移植脂肪的存活率。但其相關(guān)機理機制不清，因此本實驗研究以脂肪干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells,ASCs)和富血小板纖維蛋白(platelet-richplasma，PRF)作為改善移植脂肪血管化微環(huán)境，探討ASCs和PRF在改善脂肪移植效果及其相關(guān)作用機理。
　　【目的】
　　探討A

3、SCs、PRF改善脂肪移植效果及其相關(guān)作用機理，為構(gòu)建新型脂肪組織工程復(fù)合材料提供理論和實驗依據(jù)。
　　【方法】
　　1、從家兔脂肪組織中分離培養(yǎng)出脂肪干細(xì)胞，通過HE染色，MTT法測定細(xì)胞生長曲線，成脂和成骨誘導(dǎo)分化和流式細(xì)胞儀檢測對干細(xì)胞相關(guān)特性進(jìn)行鑒定。
　　2、兔ELISA試劑盒檢測PRF體外釋放血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)特點。將PRF對ASCs的體外影響作用實驗，分為四組，0PRF(空白對照),1PRF,3

4、PRF,5PRF,通過MTT實驗繪制ASCs生長曲線，成脂和成骨誘導(dǎo)，流式細(xì)胞檢測等分析體外PRF對ASCs的相關(guān)影響特性。
　　3、移植脂肪組織大體觀察，通過肉眼照相觀察移植脂肪的形態(tài)體積大小變化。
　　4、通過游標(biāo)卡尺和動物B超儀在術(shù)后規(guī)定時間點測量移植脂肪體積變化情況，并根據(jù)體積公式(V=a×b×c×0.5,a:縱徑，b:橫徑，c:厚度)計算各組移植脂肪組織的體積存活率(吸收率)，存活率(％)=（術(shù)后各時間點測量的體積

5、/術(shù)后當(dāng)天移植脂肪體積）ⅹ100，吸收率(％)=（1-存活分?jǐn)?shù)）ⅹ100。
　　5、組織學(xué)分析法。術(shù)后根據(jù)不同時間點取材進(jìn)行石蠟切片，然后行組織HE染色和CD31免疫組織化學(xué)染色，觀察不同組別的移植脂肪的組織學(xué)形態(tài)差異及血管生成情況。
　　6、數(shù)據(jù)采集及統(tǒng)計分析。結(jié)果采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組資料采用ANOVA單因素方差分析法比較四組間的存活率/吸收率及微血管生成的差異。
　　7、對各組移植脂肪組織微血

6、管密度及PRF對ASCs誘導(dǎo)成脂和成骨染色圖片，采用Image-ProPlus圖像分析軟件處理得到各組圖片累計光密度值(Integratedopticaldensity,IOD)，然后采用ANOVA單因素方差分析法比較各組間差異。
　　【結(jié)果】
　　1、從家兔脂肪組織分離培養(yǎng)的ASCs形態(tài)呈現(xiàn)為梭形，具有較強的自我更新和增殖能力，能表達(dá)干細(xì)胞特異性的表面抗原，有向成脂和成骨方向分化潛能，生物學(xué)特性穩(wěn)定。
　　2、PRF

7、體外能持續(xù)釋放VEGF，PRF對ASCs的增殖和成脂和成骨分化起到較明顯的促進(jìn)作用，PRF對ASCs的作用呈劑量依賴效應(yīng)。
　　3、移植脂肪存活率
　　四組存活率比較可知，1、3、6月PRF復(fù)合自體脂肪干細(xì)胞及自體脂肪顆粒組(PRF+ASCs+AG)成活率(％)最高，分別為：(72.50±3.70)％，(70.71±4.08)％，(71.78±5.78)％，純脂肪顆粒組(AG)存活率最低：(50.83±5.97)％，(40.

8、45±10.32)％，(34.20±10.61)％。
　　4、HE染色組織學(xué)分析
　　脂肪移植早期(1W～4W)，PRF+ASCs+AG組脂肪組織血管化構(gòu)建和組織學(xué)改建速度最快，組織纖維化和炎癥浸潤程度較輕,而AG組血管構(gòu)建及組織學(xué)改建較慢，炎癥浸潤程度較重，脂肪組織纖維化、囊性變等多見。術(shù)后3M，四組移植脂肪組織已基改建完成，鏡下組織形態(tài)無明顯差異，脂肪細(xì)胞形態(tài)較規(guī)整，整體結(jié)構(gòu)與正常脂肪組織形態(tài)結(jié)構(gòu)接近。
　　5、成

9、脂和成骨及微血管密度Image-ProPlus圖像軟件分析
　　Image-ProPlus6.0圖像分析軟件處理結(jié)果表明，成脂和成骨相關(guān)染色圖片中5PRF組其累積光密度（IOD）值最高，3PRF組次之，1PRF組再次之，0PRF組最低。采用單因素ANOVA方差分析LSD法對各組間進(jìn)行兩兩比較，各組間比較均有統(tǒng)計意義，P<0.05。
　　PRF+ASCs+AG組微血管密度IOD值最高(14284.24±4.81*103)，而A

10、G組為最低(1921.27±777.72)，組間比較有顯著統(tǒng)計意義，P<0.05。
　　【結(jié)論】
　　1、從家兔脂肪組織分離培養(yǎng)出的細(xì)胞為脂肪干細(xì)胞，具有多向分化潛能和自我增殖能力。
　　2、PRF體外能釋放持續(xù)釋放VEGF，且PRF有促進(jìn)ASCs的增殖和向成脂和成骨分化的作用。
　　3、PRF復(fù)合ASCs在脂肪移植中起到重要作用，能有效改善移植脂肪的血管化作用和提高移植脂肪的存活率。
　　4、以自體脂肪顆