同步輻射技術檢測干細胞移植后大鼠后肢新生血管生成的實驗研究.pdf

1、第一部分同步輻射成像技術檢測大鼠后肢微血管的實驗研究
　　目的：目前臨床應用的血管成像技術無法檢測直徑在200微米以下的微小血管。同步輻射(Synchrotron Radiation，SR)成像技術的發(fā)展為檢測更細的微血管提供了新的手段。本實驗旨在利用同步輻射微血管成像技術對大鼠后肢的微血管進行成像觀察，并且和傳統(tǒng)的X線成像對比，為進一步的實驗提供必要的成像參數(shù)和基礎。
　　材料和方法：利用同步輻射單色光對F344近交系大鼠

2、的左后肢微血管進行活體和離體成像觀察?；铙w成像為吸收成像，從對側(cè)髂動脈穿刺置管至腹主動脈分叉，注射含碘造影劑同時造影成像，單色光能量設為33.4Kev。離體成像的標本制備采用硫酸鋇和生理鹽水作為對比劑注入大鼠后肢微循環(huán)，采用相位襯度成像，能量和物像距離分別為15Key和800mm，同時進行微CT血管三維重建?；铙w成像和離體成像分別采用數(shù)字減影血管造影(Digital subtraction angiography，DSA)造影和普通X線

3、攝片作為對照，比較血管的直徑和造影評分的差異。同步輻射成像分別用分辨率為9μm/pixel和2.25μm/pixel的探測器進行檢測。血管直徑的計算和圖像編輯用NIH Image-pro plus軟件進行處理。
　　結(jié)果：同步輻射微血管活體成像可清晰顯示大鼠髂動脈的4級以上分支，最細血管直徑約40μm；而普通DSA造影則無法顯示如此清晰的微血管，只能顯示髂動脈的3級分支。離體標本中，灌注生理鹽水的標本可辨認血管，但襯度和“邊緣增強

4、”效應不明顯。灌注硫酸鋇的樣本血管清晰可見，高分辨率CCD(2.25μm)可測量的最小血管直徑為9μm。而標本經(jīng)普通X光成像，血管顯影差?；铙w和離體同步輻射成像的血管造影評分明顯高于普通X線成像。對灌注硫酸鋇的整體肢體進行同步輻射微血管三維成像發(fā)現(xiàn)，肢體血管樹的三維結(jié)構(gòu)清晰顯示，可以測量和定位大鼠后肢中微米級別的微血管。
　　結(jié)論：應用同步輻射成像技術以及合適的對比劑可清晰顯示大鼠后肢的微循環(huán)，和普通X線成像相比，同步輻射血管成像

5、可顯示更為細微的內(nèi)容，最細可檢測到直徑10μm左右的大鼠后肢血管。同步輻射成像技術可為進一步檢測干細胞移植后生成的新生血管提供有效手段。
　　第二部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)和定向分化能力的研究
　　目的：骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)移植為治療下肢缺血性疾病開辟了一個新的思路，但是關于它的分離培養(yǎng)方法以及定向分化能力目前仍然缺乏統(tǒng)一的觀點。本實驗旨在從大鼠骨髓中獲取間充質(zhì)

6、干細胞并進行原代培養(yǎng)和鑒定，研究培養(yǎng)方法和接種密度對細胞形態(tài)和定向分化能力的影響，為進一步的干細胞移植實驗提供基礎。
　　材料和方法：取6-8周齡F344大鼠的骨髓以全骨髓貼壁法進行原代培養(yǎng)，并以不同的比例和接種密度(3×10、3×102、3×103 cells/cm2)進行傳代，觀察接種密度對細胞形態(tài)和生長特點的影響。按適宜的接種密度對細胞進行傳代，取第3代對數(shù)生長期的rMSCs，對其表面標志物用流式細胞儀和免疫熒光進行鑒定。同

7、時在傳代的rMSCs培養(yǎng)液中分別添加不同的化學試劑和細胞因子，觀察細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，誘導其向成骨細胞、脂肪細胞和內(nèi)皮細胞分化，并對分化的細胞用堿性磷酸酶、油紅O和DiI-Ac-LDL吞噬實驗進行鑒定。
　　結(jié)果：原代培養(yǎng)的rMSCs呈較強的貼壁生長特性，形態(tài)上呈紡錘形或扁平多角形。當細胞按接種密度3×10 cells/cm2進行傳代時，細胞的倍增速度最快，并且形態(tài)較均一，紡錘形的細胞數(shù)量多，呈菌落樣生長。對低密度接種培養(yǎng)的rMS

8、Cs進行流式細胞儀和免疫熒光鑒定，提示rMSCs的表面抗原為CD34(-)、CD45(-)、CD90(+)、CD29(+)、CD105(+)。定向分化實驗表明，在不同的誘導條件下，低密度接種培養(yǎng)的rMSCs可以向成骨細胞、脂肪細胞和內(nèi)皮細胞定向分化，分化后的細胞用堿性磷酸酶、油紅O和DiI-Ac-LDL吞噬實驗鑒定為陽性反應。
　　結(jié)論：全骨髓貼壁培養(yǎng)法和較低接種密度培養(yǎng)可獲得數(shù)量較多的相對較純的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，其表面標志物

9、符合間充質(zhì)干細胞標準，并且具有多能定向分化能力。
　　第三部分同步輻射技術檢測干細胞移植后大鼠后肢新生血管生成的實驗研究
　　目的：目前干細胞移植后新生血管的生成缺乏切實有效的評價方法。本研究應用同步輻射技術檢測大鼠骨髓間充質(zhì)細胞(Rat bone marrow-derivedmesenchymal stem cells，rBMSC)移植到大鼠缺血肢體后新生血管(Neovascularization)的生成情況，觀察分析干細

10、胞移植后新生血管空間密度分布和形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，為干細胞移植治療缺血性疾病的效果評價提供新的思路和有效檢測手段。
　　材料和方法：取F344近交系大鼠24只，制作左后肢缺血模型后隨機分為rBMSC移植組(A組)、PBS對照組(B組)和假手術組(C組)接受治療。在細胞移植后第3天、14天和21天采用同步輻射微血管吸收成像技術對各組動物的左后肢新生血管進行活體成像觀察，于細胞移植后第4周進行同步輻射離體成像分析和檢測，評估各階段新生血管

11、形態(tài)和密度的變化。同時對各組動物用激光多普勒血流灌注成像(Laser-Doppler perfusion imaging，LDPI)檢測缺血后肢血流情況和對缺血后肢損傷功能進行評分，并用免疫組化法檢測毛細血管密度，比較分析各組血流灌注指數(shù)(Perfusion ratio，PR)和新生血管密度的差異。
　　結(jié)果：同步輻射微血管活體成像提示，術后第14天和第21天，A組和B組的血管密度和造影評分均較第3天明顯增高，且A組的血管造影評分

12、明顯高于B組(14天，0.54±0.036 vs0.34±0.032；21天，0.64±0.037 vs0.49±0.027，P<0.05)。比較第21天A、B兩組的血管形態(tài)發(fā)現(xiàn)，A組的新生血管形態(tài)和排列較B組血管規(guī)則。C組的血管形態(tài)密度在術后的隨訪中基本保持一致。LDPI檢測提示細胞移植第7天以后，A組動物缺血肢體的血流灌注指數(shù)明顯高于B組。缺血后肢損傷評分的結(jié)果顯示A組損傷評分明顯低于B組。同步輻射離體成像分析提示A組的新生血管密度