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文檔簡介
1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
第一部分 rAAV1-9對人臍帶血晚期內(nèi)皮祖細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的研究
目的:
觀察rAAV1-9對人臍帶血晚期內(nèi)皮祖細胞(HUCB-late EPCs)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,篩選合適的重組腺相關(guān)病毒血清型作為攜帶CXCR4基因的載體。
方法:
1.用PEI介導(dǎo)表達綠色熒光蛋白(GFP)的rAAV包裝系統(tǒng)(pAAV-CMV-GFP,pAAV-RC1-9和pHelper)
2、轉(zhuǎn)染HEK293細胞分離獲得不同血清型表達綠色熒光蛋白(GFP)的rAAV-GFP,濃縮純化病毒,以SDS-PAGE法檢測病毒純度和qPCR法測定病毒滴度。根據(jù)實驗結(jié)果,選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高的重組腺相關(guān)病毒血清型作為攜帶CXCR4基因的載體,以同樣的方法獲取rAAV-CXCR4;
2.密度梯度離心法分離臍帶血單個核細胞(MNCs),將其誘導(dǎo)培養(yǎng)為EPCs,連續(xù)培養(yǎng)4周獲得晚期內(nèi)皮祖細胞(late endothelial proge
3、nitor cellslate EPCs);
3.將late EPCs種植到24孔板中(每孔1×104個),加入濃縮、純化后的重組腺相關(guān)病毒(rAAV1至rAAV9),感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infectionMOI)為100,000 viral genomes/cell,每種血清型病毒重復(fù)3次;用ImagePro Plus6.0圖像分析軟件計算不同感染時間(6h,12h,18h,24h,30h,36 h)表
4、達GFP的EPCs比例,計算轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
結(jié)果:
1.成功構(gòu)建了表達綠色熒光蛋白(GFP)的rAAV血清型(rAAV1-9-GFP),經(jīng)純化濃縮后病毒的滴度均超過2.0×109vg/μl,rAAV6-CXCR4的滴度為2.88×109vg/μ l。
2.人臍帶血單個核細胞(MNCs)經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后,經(jīng)形態(tài)學(xué)、細胞表面標(biāo)記及生物學(xué)特征鑒定為late EPCs。
3.rAAV1-9對Late EPC
5、s的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率存在明顯差異,rAAV6的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高(0.5208±0.0147),rMV2次之(0.4506±0.011),rMV4的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最低(0.1382±0.0102),P<0.05。
第二部分 CXCR4基因過表達HUCB-late EPCs移植對大鼠后肢缺血組織血管新生的影響
目的:
1.觀察轉(zhuǎn)染rAAV6-CXCR4和rAAV6-GFP后,HUCB-late EPCs的體外成血管能力。
6、 2.觀察CXCR4基因過表達HUCB-late EPCs移植對大鼠后肢缺血組織血管新生的影響。
方法:
1.用rAAV6-CXCR4、rAAV6-GFP感染人臍帶血late EPCs,Western Blot檢測CXCR4蛋白表達水平。
2.設(shè)立rAAV6-CXCR4感染組、rAAV6-GFP感染組和空白組,應(yīng)用基質(zhì)膠成血管實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞的體外成血管能力。
3.構(gòu)建SD大鼠后肢缺血模型。6
7、周齡雄性SD大鼠18只,SD大鼠稱重后,腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉。以一側(cè)股動脈及分支結(jié)扎、離斷的方法構(gòu)建后肢缺血模型。
4.隨機分為實驗組、對照組、空白組,每組6只。實驗組缺血后肢肌內(nèi)直接注射500μ l含1×106個CXCR4過表達內(nèi)皮祖細胞的EGM-2、對照組缺血后肢肌內(nèi)直接注射500μl含1×106個內(nèi)皮祖細胞的EGM-2、空白對照組缺血后肢肌內(nèi)直接注射500μ lEGM-2。28天后,脫頸法處死
8、動物,立即取缺血后肢腓腸肌,放入10倍體積的4%多聚甲醛固定。
5.HE染色檢測缺血后肢肌肉間、肌肉旁微小血管情況;免疫組織化學(xué)染色檢測肌肉間、肌肉旁新生血管CD31陽性內(nèi)皮細胞的表達情況,并計算CD31陽性新生微血管數(shù)量。
結(jié)果:
1.rAAV6-CXCR4感染組HUCB-late EPCs中CXCR4蛋白的表達高于rAAV6-GFP感染組和對照組。
2.3組均在基質(zhì)膠上成功形成管腔樣結(jié)構(gòu),單位
9、面積基質(zhì)膠形成的管腔面積分別為0.531±0.023mm2、0.514±0.026mm2、0.523±0.021mm2.,rAAV6-CXCR4、rAAV6-GFP感染對late EPCs的體外成血管能力無影響(P>0.05)。
3.與空白組比較對照組和實驗組CD31+表達的新生微血管明顯增多,實驗組新生微血管表達數(shù)量較對照組多(P<0.05),分別為:肌肉間(2.32±0.90、5.18±0.86、8.39±0.91);肌肉
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