骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植聯(lián)合參芪通脈湯治療大鼠后肢缺血的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal.stem cells，MSCs)的分離、體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的方法，對MSCs進(jìn)行鑒定，觀察骨髓干細(xì)胞的生物學(xué)特性。研究聯(lián)合應(yīng)用參芪通脈湯是否可以增強(qiáng)MSCs移植治療大鼠后肢缺血的效果，并且探討其可能的機(jī)制。 方法：使用骨髓腔沖洗法采集大鼠骨髓血，通過密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法得到純化的MSCs，在含有10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增MSCs。通過細(xì)胞形態(tài)、貼壁生長特

2、性、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞CD29、CD44、CD11b、CD45的表達(dá)，對培養(yǎng)的MSCs進(jìn)行鑒定。觀察MSCs的細(xì)胞形態(tài)、生長速度、繪制MSCs的生長曲線、測定MSCs克隆形成率，凍存復(fù)蘇MSCs后觀察其存活率和生長狀態(tài)。觀察DAPI標(biāo)記MSCs的效率和對MSCs生長狀態(tài)的影響。Wistar。大鼠24只，結(jié)扎右側(cè)股動脈及其分支，制備成大鼠后肢動脈缺血模型，并隨機(jī)分為3組，每組8只，分別是對照組、MsCs組和MSCs+中藥組。股動脈結(jié)扎術(shù)后

3、24h，MSCs組和MSCs+中藥組大鼠給予含有MSCs(1×10<'7>cells)DMEM 0.4ml注射于患肢缺血肌肉組織中，對照組的大鼠僅注射DMEM中藥+MSCs組大鼠于股動脈結(jié)扎術(shù)后24h開始口服參芪通脈湯制劑，每天早晚各一次，連續(xù)3周。股動脈結(jié)扎術(shù)后第22d，行激光多譜勒血流灌注成像(laser Doppler perfusion imaging，LDPI)檢查患肢血流灌注恢復(fù)情況，免疫組織化學(xué)染色檢查VEGF在組織中的表

4、達(dá)。 結(jié)果：使用密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法可以得到高純度的MSCs，MSCs可以通過體外培養(yǎng)大量擴(kuò)增。通過本方法培養(yǎng)的MSCs貼壁生長，呈典型的梭形形狀，漩渦狀排列。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型CD29、CD44表達(dá)陽性，CD11b、CD45表達(dá)陰性，符合MSCs的特征。觀察細(xì)胞生長特性發(fā)現(xiàn)：MSCs呈貼壁生長，原代培養(yǎng)9-12d可以達(dá)到90％融合，傳代后的MSCs增殖速度較原代培養(yǎng)明顯增快，第3代的MSCs已基本純化。隨著傳代的增加

5、，體外培養(yǎng)的MSCs生長增殖能力逐漸減弱，克隆形成率逐漸降低。凍存1個(gè)月和6個(gè)月后復(fù)蘇的MSCs生存率分別為90％和85％，復(fù)蘇后的細(xì)胞生長狀態(tài)良好。DAPI標(biāo)記MSCs的有效率為100％，標(biāo)記48h后熒光顯色無明顯減弱，DAPI標(biāo)記的MSCs的細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)無明顯變化。LDPI檢查顯示MSCs+中藥組和MSCs組明顯強(qiáng)于對照組(P<0.01)，MSCs+中藥組最強(qiáng)，免疫組織化學(xué)染色和計(jì)算機(jī)圖像分析顯示MSCs+中藥組較MSCs組和