柑桔粉虱和褐色桔蚜魚尼丁受體基因的克隆與選擇性剪接分析.pdf

1、魚尼丁受體（Ryanodine Receptor）是一類控制Ca2+從胞內(nèi)鈣庫向外釋放的配體門控鈣離子通道，主要在肌肉細胞的肌漿網(wǎng)和神經(jīng)元的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中存在，對維持細胞內(nèi)Ca2+濃度的穩(wěn)定具有不可替代的作用。哺乳動物有3種不同類型的魚尼丁受體，包括RyR1、RyR2和RyR3。而昆蟲體內(nèi)只存在1個編碼魚尼丁受體的基因，且在氨基酸水平上與哺乳動物3種同工型魚尼丁受體的同源性均不高于50％，這為研制對人畜低毒而對害蟲高效的化學藥劑提供了可能。柑

2、桔粉虱和褐色桔蚜均屬半翅目柑桔害蟲。近年來，由于桔園品種種植單一、化學農(nóng)藥過度使用甚至濫用，大量桔園害蟲的天敵被殺死，造成生態(tài)系統(tǒng)失去平衡，害蟲抗藥性問題愈發(fā)嚴重。因此，以魚尼丁受體為作用靶標的雙酰胺類殺蟲劑逐漸成為研究的熱點。據(jù)此，本學位論文針對柑桔粉虱和褐色桔蚜魚尼丁受體及其選擇性剪接進行了較為系統(tǒng)的研究工作，旨在為研制出以該基因為作用靶標的高效、安全殺蟲劑提供理論基礎(chǔ)。本論文主要研究結(jié)果如下：
　　1.柑桔粉虱和褐色桔蚜對常

3、用殺蟲劑的敏感性測定
　　利用改進后的濾紙藥膜法和玻片浸漬法，對采自學校網(wǎng)室的柑桔粉虱和褐色桔蚜對5種常用殺蟲劑（阿維菌素、氯蟲苯甲酰胺、吡蟲啉、毒死蜱、高效氯氰菊酯）的敏感性進行了測定。結(jié)果表明，5種藥劑對柑桔粉虱的毒殺作用由強到弱分別為阿維菌素、吡蟲啉、氯蟲苯甲酰胺、毒死蜱和高效氯氰菊酯，而對褐色桔蚜的毒殺作用由強到弱依次為吡蟲啉、氯蟲苯甲酰胺、毒死蜱、高效氯氰菊酯和阿維菌素。
　　2.柑桔粉虱和褐色桔蚜魚尼丁受體基因的

4、克隆及結(jié)構(gòu)分析
　　基于柑桔粉虱和褐色桔蚜轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，利用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）分別克隆得到2種害蟲的魚尼丁受體基因DcRyR和TciRyR編碼完整開放閱讀框（ORF）的cDNA序列。其中，DcRyR的ORF長15,381bp，編碼5,126個氨基酸殘基，GenBank登錄號為KP733848，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為579.45KDa，等電點為5.49。TciRyR的ORF長15,315bp，編碼5,104個氨基酸殘

5、基，GenBank登錄號為KP733849，預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為580.08kDa，等電點為5.49。
　　氨基酸序列分析表明，DcRyR和TciRyR與其他昆蟲魚尼丁受體的相似性介于70%-90%之間。其中，柑桔粉虱DcRyR與煙粉虱BtRyR氨基酸序列相似度最高，相似性為95.1%。褐色桔蚜TciRyR與桃蚜MpRyR、豌豆蚜ApRyR的親緣關(guān)系最近，相似性分別高達98.2%和98.1%。然而，DcRyR和TciRyR與哺乳動物

6、的相似性僅在43%-46%之間。
　　對柑桔粉虱和褐色桔蚜魚尼丁受體基因結(jié)構(gòu)域的預(yù)測發(fā)現(xiàn)，DcRyR和TciRyR均具有許多魚尼丁受體重要的功能結(jié)構(gòu)區(qū)域，如SD結(jié)構(gòu)域、MIR（甘露糖轉(zhuǎn)移酶）結(jié)構(gòu)域、2個RIH（RyR和IP3R同源）結(jié)構(gòu)域、3個SPRY（SPla和RyR）結(jié)構(gòu)域、4個RYR重復(fù)結(jié)構(gòu)域及RIH associated。在C末端均存在6個跨膜結(jié)構(gòu)域（TM1-TM6），分別對應(yīng)6個高度疏水區(qū)域。此外，DcRyR和TciRy

7、R均存在EF-hands、pore helix和作為Ca2+釋放通道的孔道形成區(qū)域一部分的GXRXGGGXGD基序，且以上序列與其他已知的魚尼丁受體基因序列相似度極高。總的來講，DcRyR和TciRyR具有魚尼丁受體的全部典型結(jié)構(gòu)區(qū)域，具有結(jié)構(gòu)上和功能上的保守性。
　　3.柑桔粉虱和褐色桔蚜魚尼丁受體基因mRNA表達分析
　　熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，DcRyR和TciRyR在2種害蟲不同發(fā)育階段和不同體段的樣品中均有所表

8、達。其中，DcRyR mRNA表達量在柑桔粉虱成蟲頭部和胸部顯著高于腹部，DcRyR mRNA的表達量在卵期最高而在若蟲期最低。TciRyR的表達量在褐色桔蚜成蟲期頭部高表達，在胸部和腹部的表達水平無顯著性差異。
　　4.柑桔粉虱和褐色桔蚜魚尼丁受體基因選擇性剪接分析
　　通過對DcRyR多個cDNA克隆測序，序列分析發(fā)現(xiàn)DcRyR存在2種類型共4個選擇性剪接子，包括2個選擇性外顯子（AS1a和AS1d）和1對互斥外顯子（A

9、S1b和AS1c）。通過特異性PCR檢測發(fā)現(xiàn)以上4個外顯子在柑桔粉虱不同體段和不同發(fā)育階段的表達頻率存在差異。其中，AS1a(+)在柑桔粉虱成蟲胸部發(fā)生的頻率較高，AS1d(+)在若蟲期更容易發(fā)生。而AS1b/c作為互斥外顯子，AS1b在所有發(fā)育階段和體段的發(fā)生頻率均高于AS1c。同樣，通過對TciRyR多個cDNA克隆測序，序列分析發(fā)現(xiàn)TciRyR僅存在1個選擇性剪接位點（AS2），進一步克隆其基因組序列，分析發(fā)現(xiàn)該選擇性剪接由內(nèi)含子

10、保留機制所致，并會導致蛋白質(zhì)翻譯的提前終止。在對TciRyR選擇性外顯子的特異性PCR檢測研究中發(fā)現(xiàn)AS2(-)在若蟲和成蟲以及成蟲頭部、胸部和腹部的表達頻率均顯著高于AS2(+)。
　　綜上所述，本學位論文對柑桔粉虱和褐色桔蚜校內(nèi)網(wǎng)室種群對常用殺蟲劑的敏感性進行了監(jiān)測；基于柑桔粉虱和褐色桔蚜的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別克隆得到其魚尼丁受體基因DcRyR和TciRyR，分析了功能結(jié)構(gòu)區(qū)域特性；采用熒光定量PCR技術(shù)解析了這2個基因分別在2種