細胞體內分離鑒定RNA結合蛋白結合的靶mRNA技術的建立和驗證.pdf

1、轉錄后水平的基因表達調控是細胞生長和分化過程中最重要的調節(jié)機制之一。轉錄后水平的調控會影響很多基因的蛋白表達水平和細胞內蛋白表達的特定位置，從而影響細胞的分化方向。RNA結合蛋白是轉錄后水平基因表達調控的主要承擔者。RNA結合蛋白(RNA-bindingprotein，RBP)多具有保守的RNA結合模體(RNA-bindingmotifs，RBM)，其所結合的靶RNA也多具有特異結構或序列，RNA結合蛋白通過RNA結合模體來特異地與靶R

2、NA的特異結構或序列結合，進而調節(jié)這些RNA的剪輯、運輸、穩(wěn)定性和翻譯等。體內分離和鑒定RNA結合蛋白的核糖核蛋白復合體已成為基因組后時期的一個具有重要意義的挑戰(zhàn)。 本工作建立了一種能夠全景式分離鑒定RNA結合蛋白靶mRNA的技術平臺。本技術平臺的路線是：分別構建生物素連接酶(BirA)基因、可生物素化多肽標簽(BAP)-RNA結合蛋白融合基因的真核表達載體。共轉染上述真核表達載體至細胞內使其表達，在生物素存在的前提下，利用生物

3、素連接酶(BirA酶)使可被生物素化的多肽標簽進行生物素化，通過StreptavidinSepharose-beads的一步純化，即可獲得與多肽標簽融合表達的RNA結合蛋白及其靶mRNA，即核糖核蛋白復合體Ribonucleoprotein，RNP。工作中通過Westernblot方法驗證了該項技術路線的可靠性，表明StreptavidinSepharose-beads的一步純化法可以簡便得到核糖核蛋白復合體。本工作還通過RT-PCR方