多能干細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Nanog和Oct4的RNA結(jié)合蛋白的鑒定和研究.pdf

1、多能干細(xì)胞有一種獨(dú)特的特性就是它們可以進(jìn)行自我更新并且可以分化成所有細(xì)胞類型。多能干細(xì)胞干性維持機(jī)制一直是科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)，之前的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄因子如何與下游靶基因相互作用從而調(diào)控一系列多能性基因和分化基因的表達(dá)這一方向，這些轉(zhuǎn)錄因子包括Oct4，Nanog，Sox2。他們組成了控制多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體中心。這個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體跟其他的轉(zhuǎn)錄因子在維持多能干細(xì)胞多潛能性方面共同起著基礎(chǔ)性的調(diào)控作用。
　　隨著研究的

2、進(jìn)行，人們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過(guò)程對(duì)于真核基因的表達(dá)有著更強(qiáng)烈的影響，這一過(guò)程通過(guò)特異性針對(duì)mRNA的方式調(diào)控著mRNA代謝的每一個(gè)階段，包括選擇性剪切，核轉(zhuǎn)運(yùn)，mRNA代謝，細(xì)胞分裂，定位和翻譯等步驟。另外值得注意的是，在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中通常是沒(méi)有轉(zhuǎn)錄行為發(fā)生的，而細(xì)胞分裂、細(xì)胞命運(yùn)決定等細(xì)胞內(nèi)一系列重要決定也是在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中做出的。正是由于這個(gè)原因，早期胚胎發(fā)育過(guò)程和干細(xì)胞自我更新過(guò)程中基因的表達(dá)調(diào)控主要依賴于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控來(lái)進(jìn)行

3、的。
　　我們的研究正是從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控入手探討調(diào)控多能干細(xì)胞多能性維持和分化基因表達(dá)的可能性機(jī)制，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中mRNA代謝是由一系列RNA結(jié)合蛋白與靶基因mRNA相互作用實(shí)現(xiàn)的。因此我們選擇Nanog這個(gè)多能干細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子作為我們的研究對(duì)象，通過(guò)鑒定和驗(yàn)證Nanog的RNA結(jié)合蛋白，并分析這些RNA結(jié)合蛋白對(duì)于多能干細(xì)胞多能性維持的功能性作用，繼而分析它們的RNA結(jié)合蛋白是怎樣通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來(lái)控制Nanog的mRNA代謝過(guò)

4、程的。同時(shí)我們也初步鑒定了與Oct4相互作用的RNA結(jié)合蛋白，為以后研究Oct4轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。
　　我們首先用體外鏈霉素標(biāo)簽親和層析技術(shù)分離了Nanog和Oct4的RNA結(jié)合蛋白，并且用高效液相色譜和質(zhì)譜鑒定出了Nanog118個(gè)Nanog的RNA結(jié)合蛋白和114個(gè)Oct4的RNA結(jié)合蛋白。繼而又重點(diǎn)從Nanog RNA結(jié)合蛋白中根據(jù)功能和肽段匹配分值篩選出8個(gè)最可信的RNA結(jié)合蛋白做進(jìn)一步驗(yàn)證和功能研究，Western

5、 Blot驗(yàn)證8個(gè)候選RNA結(jié)合蛋白證明與質(zhì)譜鑒定出的結(jié)果是一致的，RNA免疫共沉淀驗(yàn)證這些候選 RNA結(jié)合蛋白確定在細(xì)胞內(nèi)部也與Nanog RNA有相互作用關(guān)系，我們還用體內(nèi)分離 RNA結(jié)合蛋白的方法即MS2-BioTRAP親和純化技術(shù)來(lái)獲取與Nanog mRNA在細(xì)胞內(nèi)部相互作用的RNA結(jié)合蛋白，之后對(duì)體內(nèi)方法獲取的RNA結(jié)合蛋白進(jìn)行Western Blot驗(yàn)證初步證實(shí)了其中確實(shí)含有體外方法鑒定得到的候選RNA結(jié)合蛋白。其中我們挑選

6、了2個(gè)在RNA免疫共沉淀驗(yàn)證中被認(rèn)為與Nanog RNA結(jié)合能力最強(qiáng)的RNA結(jié)合蛋白YBX1和ILF3作為對(duì)多能干細(xì)胞多潛能性維持是否有功能性調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵基因進(jìn)行驗(yàn)證，我們采用了RNA干擾的方法降低YBX1和ILF3基因表達(dá)量，分析它們對(duì)小鼠多能干細(xì)胞多潛能性基因和分化基因表達(dá)的影響，結(jié)果證明干擾YBX1和ILF3基因表達(dá)會(huì)明顯降低小鼠多能干細(xì)胞多潛能性基因的表達(dá)量，同時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致多能干細(xì)胞向中胚層分化，之后ILF3干擾細(xì)胞的全基因組

7、芯片研究表明表達(dá)量變化明顯的基因很多都是關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Nanog，Oct4，Sox2靶向結(jié)合的基因，因此我們推測(cè)干擾ILF3可能對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Nanog，Oct4，Sox2的下游靶向作用基因的影響很大，同時(shí)在一定程度上也說(shuō)明了轉(zhuǎn)錄因子的上游調(diào)控元件可能是通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)繼而控制下游基因的表達(dá)的。而根據(jù)之前研究提出的結(jié)論，Nanog是由Oct4和Sox2轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的，我們的研究發(fā)現(xiàn)ILF3作為Nanog的上游調(diào)控因子（RNA結(jié)合蛋白），