多能干細胞關鍵轉錄因子Nanog和Oct4的RNA結合蛋白的鑒定和研究.pdf

1、多能干細胞有一種獨特的特性就是它們可以進行自我更新并且可以分化成所有細胞類型。多能干細胞干性維持機制一直是科學家們研究的熱點，之前的研究主要集中在轉錄因子如何與下游靶基因相互作用從而調控一系列多能性基因和分化基因的表達這一方向，這些轉錄因子包括Oct4，Nanog，Sox2。他們組成了控制多能干細胞轉錄調控網絡的轉錄復合體中心。這個轉錄調控復合體跟其他的轉錄因子在維持多能干細胞多潛能性方面共同起著基礎性的調控作用。
　　隨著研究的

2、進行，人們發(fā)現(xiàn)轉錄后調控過程對于真核基因的表達有著更強烈的影響，這一過程通過特異性針對mRNA的方式調控著mRNA代謝的每一個階段，包括選擇性剪切，核轉運，mRNA代謝，細胞分裂，定位和翻譯等步驟。另外值得注意的是，在早期胚胎發(fā)育過程中通常是沒有轉錄行為發(fā)生的，而細胞分裂、細胞命運決定等細胞內一系列重要決定也是在早期胚胎發(fā)育過程中做出的。正是由于這個原因，早期胚胎發(fā)育過程和干細胞自我更新過程中基因的表達調控主要依賴于轉錄后水平調控來進行

3、的。
　　我們的研究正是從轉錄后水平調控入手探討調控多能干細胞多能性維持和分化基因表達的可能性機制，在轉錄后調控中mRNA代謝是由一系列RNA結合蛋白與靶基因mRNA相互作用實現(xiàn)的。因此我們選擇Nanog這個多能干細胞關鍵轉錄因子作為我們的研究對象，通過鑒定和驗證Nanog的RNA結合蛋白，并分析這些RNA結合蛋白對于多能干細胞多能性維持的功能性作用，繼而分析它們的RNA結合蛋白是怎樣通過轉錄后調控來控制Nanog的mRNA代謝過

4、程的。同時我們也初步鑒定了與Oct4相互作用的RNA結合蛋白，為以后研究Oct4轉錄后調控網絡奠定基礎。
　　我們首先用體外鏈霉素標簽親和層析技術分離了Nanog和Oct4的RNA結合蛋白，并且用高效液相色譜和質譜鑒定出了Nanog118個Nanog的RNA結合蛋白和114個Oct4的RNA結合蛋白。繼而又重點從Nanog RNA結合蛋白中根據(jù)功能和肽段匹配分值篩選出8個最可信的RNA結合蛋白做進一步驗證和功能研究，Western

5、 Blot驗證8個候選RNA結合蛋白證明與質譜鑒定出的結果是一致的，RNA免疫共沉淀驗證這些候選 RNA結合蛋白確定在細胞內部也與Nanog RNA有相互作用關系，我們還用體內分離 RNA結合蛋白的方法即MS2-BioTRAP親和純化技術來獲取與Nanog mRNA在細胞內部相互作用的RNA結合蛋白，之后對體內方法獲取的RNA結合蛋白進行Western Blot驗證初步證實了其中確實含有體外方法鑒定得到的候選RNA結合蛋白。其中我們挑選

6、了2個在RNA免疫共沉淀驗證中被認為與Nanog RNA結合能力最強的RNA結合蛋白YBX1和ILF3作為對多能干細胞多潛能性維持是否有功能性調節(jié)作用的關鍵基因進行驗證，我們采用了RNA干擾的方法降低YBX1和ILF3基因表達量，分析它們對小鼠多能干細胞多潛能性基因和分化基因表達的影響，結果證明干擾YBX1和ILF3基因表達會明顯降低小鼠多能干細胞多潛能性基因的表達量，同時可能會導致多能干細胞向中胚層分化，之后ILF3干擾細胞的全基因組

7、芯片研究表明表達量變化明顯的基因很多都是關鍵轉錄因子Nanog，Oct4，Sox2靶向結合的基因，因此我們推測干擾ILF3可能對轉錄因子Nanog，Oct4，Sox2的下游靶向作用基因的影響很大，同時在一定程度上也說明了轉錄因子的上游調控元件可能是通過調節(jié)轉錄因子的表達繼而控制下游基因的表達的。而根據(jù)之前研究提出的結論，Nanog是由Oct4和Sox2轉錄因子調控的，我們的研究發(fā)現(xiàn)ILF3作為Nanog的上游調控因子（RNA結合蛋白），