新的Poly A RNA結(jié)合蛋白Kazrin可能參與細(xì)胞內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)和定位.pdf

1、目的:
　　mRNA胞內(nèi)運(yùn)輸和定位是真核基因表達(dá)調(diào)控的重要一環(huán)，依賴細(xì)胞骨架特別是微管系統(tǒng)的主動(dòng)運(yùn)輸是其中最重要的機(jī)制。mRNA如何與馬達(dá)蛋白(motor protein)相互作用一直困擾著研究人員，我們已經(jīng)找到一個(gè)能夠即結(jié)合驅(qū)動(dòng)蛋白輕鏈(kinesin light chain，KLC)又與mRNA相互作用的新蛋白Kazrin，但是它具體與什么RNA相互作用還不清楚，本研究尋找并確定與Kazrin相互作用的核酸序列，探索性研究ka

2、zrin在細(xì)胞中mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)與定位中的可能作用。
　　方法:
　　與Kazrin蛋白相互作用位點(diǎn)的mRNA序列確定:原核表達(dá)Kazrin-GST融合蛋白，與鼠胚和鼠腦總RNA體外結(jié)合反應(yīng)，酚氯仿抽提靶RNA，使用隨機(jī)引物RT-PCR，TA克隆后篩選陽(yáng)性質(zhì)粒送測(cè)序。體外使用Northern-western Blot，體內(nèi)使用紫外交聯(lián)免疫共沉淀(UV-Crosslinked Co-IP)確定Kazrin蛋白與靶序列的相互作用。使

3、用免疫熒光和原位雜交，激光共聚焦顯微鏡觀察Kazrin蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位及與驅(qū)動(dòng)蛋白，微管系統(tǒng)的共定位關(guān)系，通過(guò)結(jié)構(gòu)分析推測(cè)Kazrin蛋白在mRNA細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與定位中的作用。
　　結(jié)果:
　　Kazrin與mRNA結(jié)合的靶序列是Poly A，體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)證明沒(méi)有Poly A就沒(méi)有相互作用。Kazrin在固定的U373細(xì)胞中可廣泛分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，與驅(qū)動(dòng)蛋白和微管蛋白在在細(xì)胞質(zhì)中有明顯的共定位關(guān)系，Kazrin與Pol