幾種綠膿桿菌外毒素融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)路徑和furin蛋白酶切速率研究.pdf

1、綠膿桿菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A,PEA)是一種革蘭氏陰性的銅綠假單胞菌屬產(chǎn)生的一種具有ADP核糖基化轉(zhuǎn)移酶功能的毒素蛋白,它通過(guò)特異性的將哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的蛋白延長(zhǎng)因子2進(jìn)行不可逆的核糖基化作用而使之失活最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。對(duì)于這一毒素蛋白的細(xì)胞致死過(guò)程中復(fù)雜的細(xì)胞分子動(dòng)力學(xué)過(guò)程也一直是人們探索的重點(diǎn)。
　　本研究通過(guò)構(gòu)建四種熒光蛋白標(biāo)記的綠膿桿菌外毒素A來(lái)對(duì)該毒素蛋白進(jìn)入細(xì)胞的過(guò)程進(jìn)行追蹤,以確定細(xì)胞

2、內(nèi)蛋白毒素進(jìn)入量與時(shí)間的關(guān)系,通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方式研究毒素蛋白在胞內(nèi)經(jīng)由酶切的效率與時(shí)間的關(guān)系,并對(duì)毒素蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)以及酶切的位置進(jìn)行了粗略的亞細(xì)胞定位。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH值的變化對(duì)PEA毒素分子進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部速率并沒(méi)有很顯著的影響,而對(duì)毒素的毒性有增強(qiáng)作用的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特定信號(hào)序列KDEL則使毒素分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等特定細(xì)胞器聚集,這主要是因?yàn)樘烊欢舅豍EA的C段序列REDLK結(jié)合到了KDEL受體而最后被運(yùn)送到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
　　在PEA毒素內(nèi)

3、化的過(guò)程中需要被細(xì)胞內(nèi)的類furin蛋白酶將其從279～280的氨基酸之間切斷才能夠表現(xiàn)出后邊催化結(jié)構(gòu)域的活性,所以在探索這一酶切過(guò)程的酶切的效率和時(shí)間以及對(duì)酶切后的片段進(jìn)行定位的需要,我們運(yùn)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescent resonance energy transferring,FRET)的方法設(shè)計(jì)了一個(gè)具有兩個(gè)熒光標(biāo)簽的PEA融合毒素蛋白,藍(lán)色熒光蛋白(Enhanced blue fluorecsent protein