細(xì)胞內(nèi)ATP濃度決定蛋白酶體抑制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的敏感性.pdf

1、背景與目的:泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的降解而參與細(xì)胞生命過(guò)程的調(diào)節(jié)。蛋白酶體是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)，蛋白酶體抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有敏感性差異。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中首次發(fā)現(xiàn)ATP濃度對(duì)26S蛋白酶體活性具有雙向調(diào)控作用，并首創(chuàng)26S蛋白酶體活性-ATP濃度模式圖。ATP是內(nèi)源性小分子，動(dòng)物不同組織的ATP濃度不一樣，推測(cè)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感性受細(xì)胞內(nèi)ATP濃度調(diào)控。本文旨在證明細(xì)胞內(nèi)ATP濃度決定蛋白酶體

2、抑制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的敏感性，為細(xì)胞內(nèi)ATP濃度調(diào)控蛋白酶體功能提供依據(jù)。 方法與結(jié)果: 1.細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的調(diào)控 選用前期實(shí)驗(yàn)已明確產(chǎn)能途徑的K562細(xì)胞（以糖酵解為主，糖的有氧氧化為輔）和H460細(xì)胞（以糖的有氧氧化占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)）為研究對(duì)象。通過(guò)干預(yù)細(xì)胞培養(yǎng)基的葡萄糖含量、使用腺苷供能（Ade）、抑制細(xì)胞的產(chǎn)能途徑[氧化磷酸化抑制劑寡霉素（OLIG）；糖酵解抑制劑2-脫氧-右葡萄糖（2DG）]等方式進(jìn)行調(diào)控。前期

3、實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的調(diào)控是可行的。 2.細(xì)胞內(nèi)ATP濃度決定蛋白酶體抑制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡敏感性的研究 2.1調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ATP濃度對(duì)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)K562細(xì)胞死亡敏感性的影響 2.1.1右糖培養(yǎng)基與無(wú)糖培養(yǎng)基對(duì)蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的影響 右旋葡萄糖是細(xì)胞內(nèi)ATP的主要來(lái)源物質(zhì)，正常培養(yǎng)基的葡萄糖是右旋葡萄糖，培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)細(xì)胞內(nèi)ATP濃度高，而使用無(wú)糖培養(yǎng)基時(shí)細(xì)胞內(nèi)ATP濃度低。 ①不同濃度的

4、MG132（0～20μM）和MG262（0～1μM）分別在右糖培養(yǎng)基與無(wú)糖培養(yǎng)基的細(xì)胞作用不同時(shí)間，Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示MG132與MG262在右糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡比無(wú)糖培養(yǎng)基細(xì)胞嚴(yán)重，并呈劑量依賴關(guān)系，MG13210μM作用12小時(shí)細(xì)胞死亡率相差24.1%，MG13220μM作用24小時(shí)細(xì)胞死亡率相差59.8%，MG2621μM作用12小時(shí)死亡率相差18.2% ②MG2621μM分別作用于右糖培養(yǎng)

5、基與無(wú)糖培養(yǎng)基細(xì)胞，應(yīng)用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變動(dòng)態(tài)觀察（相差100X），時(shí)程12小時(shí)。右糖培養(yǎng)基細(xì)胞“出芽”、凋亡小體形成、細(xì)胞破裂等細(xì)胞死亡形態(tài)學(xué)改變明顯，無(wú)糖培養(yǎng)基細(xì)胞胞膜基本完整 結(jié)果說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)ATP濃度對(duì)蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感性存在影響，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度高時(shí)蛋白酶體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡嚴(yán)重。 2.1.2右糖培養(yǎng)基與左糖培養(yǎng)基對(duì)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡敏感性的影響 左旋葡萄糖是右旋葡萄糖的對(duì)映

6、異構(gòu)體，不能代謝供能，用于平衡細(xì)胞滲透壓。 ①M(fèi)G132（5μM）、MG262（1μM）分別在右糖培養(yǎng)基與左糖培養(yǎng)基細(xì)胞作用9小時(shí)、18小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示MG132與MG262在右糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡比左糖培養(yǎng)基嚴(yán)重，藥物作用9小時(shí)細(xì)胞死亡率相差約6%，藥物作用18小時(shí)細(xì)胞死亡率相差約30%，兩藥物各自在右糖培養(yǎng)基與無(wú)糖培養(yǎng)基的細(xì)胞死亡率比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意差義，p<0.01。 ②MG132（5μM）分別在右糖培養(yǎng)

7、基與左糖培養(yǎng)基細(xì)胞作用12小時(shí)，電子透射顯微鏡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖像顯示右糖培養(yǎng)基細(xì)胞死亡改變明顯：核濃縮，染色質(zhì)呈新月狀、團(tuán)塊狀聚集在核膜周圍或核碎裂，胞漿空泡化，細(xì)胞膜破裂；左糖培養(yǎng)基細(xì)胞死亡改變表現(xiàn)為線粒體腫脹，凋亡小體形成，胞膜完整。 上述結(jié)果可排除滲透壓對(duì)蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡敏感性的影響，支持細(xì)胞內(nèi)ATP濃度高時(shí)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡嚴(yán)重。 2.1.3 Ade上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP對(duì)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡敏感性

8、的影響 ①實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用無(wú)糖培養(yǎng)基與右糖培養(yǎng)基，分對(duì)照組，Ade組，MG262組，Ade+MG262組，藥物作用24小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，右糖培養(yǎng)基細(xì)胞死亡率50.7%～82%，無(wú)糖培養(yǎng)基細(xì)胞死亡率15.8%～36.3%；Ade+MG262組與MG262組比較，在無(wú)糖培養(yǎng)基表現(xiàn)為細(xì)胞死亡加重，兩組細(xì)胞死亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在有糖培養(yǎng)基表現(xiàn)為細(xì)胞死亡由早期凋亡走向晚期凋亡，細(xì)胞死亡百分率基本不變。 ②實(shí)驗(yàn)采用右糖

9、培養(yǎng)基，分對(duì)照組，Ade組，MG262組，Ade+MG262組，MG132組、Ade+MG132組，，藥物作用18小時(shí)，LDH測(cè)定值MG262組431.31 U/L，Ade+MG262組939.3 U/L，MG132組718.85 U/L、Ade+MG132組1098.85 U/L，，Ade+MG132組與MG132組LDH值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.01，Ade+MG262組與MG262組LDH值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

10、 結(jié)果表明Ade上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP時(shí)，蛋白酶體抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡加重。 2.1.4 OLIG下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP對(duì)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡敏感性的影響。 ①OLIG在無(wú)糖培養(yǎng)基下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP對(duì)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的影響 實(shí)驗(yàn)采用無(wú)糖培養(yǎng)基，分對(duì)照組、OLIG組、Ade組、OLIG+Ade組、MG132組、MG132+OLIG組，藥物作用12小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示OLIG組細(xì)胞死亡率約40%，OLIG+Ade組未

11、見細(xì)胞死亡，MG132組細(xì)胞死亡率35.3%，OLIG+MG132組與OLIG組細(xì)胞死亡率基本相同。 ②OLIG在有糖培養(yǎng)基下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP對(duì)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的影響 實(shí)驗(yàn)采用有糖培養(yǎng)基，分對(duì)照組，OLIG組，MG262組，OLIG+MG262組、MG132組，OLIG+MG132組，藥物作用15小時(shí)，Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，OLIG+MG262組細(xì)胞死亡率33.63%，MG262組細(xì)胞死亡

12、率63.7%，兩組細(xì)胞死亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；OLIG+MG132組細(xì)胞死亡以早期凋亡為主，MG132組細(xì)胞死亡以晚期凋亡為主。 上述結(jié)果表明OLIG在無(wú)糖培養(yǎng)基下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP時(shí)，蛋白酶體抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感性基本無(wú)變化；而OLIG在右糖培養(yǎng)基中下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP時(shí)，蛋白酶體抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡減輕。 2.1.52DG下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP對(duì)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡敏感性的影響 實(shí)驗(yàn)采用有糖培養(yǎng)基，分對(duì)照組、Ad

13、e組、2DG組，2DG+MG132組，2DG+Ade+MG132組，藥物作用12小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示MG132組細(xì)胞死亡率56.15%，2DG+MG132組細(xì)胞死亡率24.75%，2DG+MG132組細(xì)胞死亡率13.7%，2DG+Ade+MG132組細(xì)胞死亡率49.8%。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明2DG在右糖培養(yǎng)基中下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP時(shí)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡減輕，而使用Ade上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP時(shí)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡加重，蛋白酶體誘

14、導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感性隨ATP濃度的改變而改變。 2.2調(diào)控ATP濃度對(duì)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)H460細(xì)胞死亡敏感性的影響 2.2.1 OLIG下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP濃度對(duì)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡敏感性的影響 實(shí)驗(yàn)采用右糖培養(yǎng)基，分對(duì)照組、OLIG組、MG132組、OLIG+MG132組，藥物作用6小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示MG132組細(xì)胞死亡率10.23%，OLIG+MG132組細(xì)胞死亡率30.27%，OLIG+MG132組與M

15、G132組細(xì)胞死亡率比較。 2.2.22DG下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP濃度對(duì)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡敏感性的影響 ①實(shí)驗(yàn)采用右糖培養(yǎng)基，分對(duì)照組、2DG組、MG132組、2DG+MG132組，藥物作用12小時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示MG132組細(xì)胞死亡率20.27%，2DG+MG132組細(xì)胞死亡率15%%，2DG+MG132組與MG132組細(xì)胞死亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 ②實(shí)驗(yàn)采用右糖培養(yǎng)基，分對(duì)照組、2DG組、MG132

16、組、2DG+MG132組，藥物作用12小時(shí)，LDH測(cè)定值MG132組373U/L，2DG+MG132組124U/L，2DG+MG132組與MG132組LDH測(cè)定值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 上述結(jié)果顯示H460細(xì)胞內(nèi)ATP下調(diào)時(shí)蛋白酶體抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡變化不一致，H460細(xì)胞的產(chǎn)能途徑以有氧氧化占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，使用OLIG抑制氧化磷酸化時(shí)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)ATP濃度大幅度下調(diào)，蛋白酶體抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡加重，而2DG使H460細(xì)胞內(nèi)ATP