抑制蛋白酶體干擾骨髓瘤細(xì)胞未折迭蛋白反應(yīng)與自噬.pdf

1、背景和目的：多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)作為一種漿細(xì)胞惡性腫瘤，其高蛋白合成與分泌活性極易導(dǎo)致未/錯折迭蛋白積聚于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，故骨髓瘤細(xì)胞極易誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmicreticulumstress，ERS）。ERS的生化基礎(chǔ)稱為未折迭蛋白反應(yīng)（unfoldedproteinresponse，URP）。UPR作為一種旨在修復(fù)、穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)，能通過IRE1α與PERK/eIFα信號通路而

2、調(diào)控分子伴侶BiP表達(dá)及轉(zhuǎn)錄因子XBP-1、CHOP的活化，其中BiP與XBP-1促進(jìn)細(xì)胞生存，而CHOP則介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。兩類信號間的紊亂失衡最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。真核細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)除了UPR，還有自噬反應(yīng)（autophagy）。自噬是真核細(xì)胞適應(yīng)營養(yǎng)或生長因子缺乏、低氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等有害刺激，由溶酶體介導(dǎo)的長壽命蛋白或細(xì)胞器的降解的一種分解性代謝反應(yīng)。自噬體形成是自噬的關(guān)鍵步驟，而自噬體形成依賴Atg5及Atg8/LC3等自噬相關(guān)蛋白與B

3、eclin1-磷脂酰肌醇三磷酸激酶(PI3K)復(fù)合物的綜合調(diào)控。研究表明，在酵母細(xì)胞中UPR既能觸發(fā)凋亡又能誘發(fā)自噬，而在骨髓瘤細(xì)胞中，UPR與自噬關(guān)系尚不清楚。
　　蛋白酶體抑制劑硼替佐米（Bortezomib）能選擇性抑制26S蛋白酶體，對多發(fā)性骨髓瘤臨床療效顯著，其抗瘤效應(yīng)可能通過干擾NF-κB信號來實現(xiàn)，然而最近發(fā)現(xiàn)NF-κB抑制劑誘發(fā)骨髓瘤細(xì)胞凋亡的程度卻遠(yuǎn)不及蛋白酶體抑制劑顯著。提示NF-κB途徑不能完全解釋硼替佐米的

4、抗瘤效應(yīng)。近年報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡為硼替佐米的重要效應(yīng)機制，但其具體調(diào)控過程尚不清楚。考慮到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與UPR及自噬調(diào)控之間的相互關(guān)系，以及UPR與自噬在骨髓瘤細(xì)胞死亡調(diào)控中的作用，我們設(shè)想，硼替佐米極可能通過影響UPR與自噬的調(diào)控過程而發(fā)揮其抗骨髓瘤效應(yīng)。
　　方法和結(jié)果：為了探討骨髓瘤細(xì)胞UPR與自噬之間的關(guān)系，我們繪制了經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激劑和/或自噬誘導(dǎo)劑處理骨髓瘤細(xì)胞H929和RPMI8226的劑量-效應(yīng)曲線，確定了所用

5、藥物的實驗濃度，并采用Westernblot檢測靶細(xì)胞UPR和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明：(1)采用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素分別處理H929和RPMI8226細(xì)胞不同時間后，靶細(xì)胞中UPR相關(guān)蛋白XBP-1s、XBP-1u、BiP、CHOP和自噬相關(guān)蛋白LC-3、Beclin-1、Atg-5、PI3KC3的表達(dá)均呈時間依賴性的增加；(2)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激劑BFA或Tg處理不同時間后，H929和RPMI8226細(xì)胞凋亡率及上述UPR相關(guān)蛋白和

6、自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)均呈時間依賴性的增加；(3)雷帕霉素能干擾BFA或Tg誘導(dǎo)的UPR相關(guān)蛋白的表達(dá)；(4)BFA或Tg可以干擾雷帕霉素誘發(fā)的自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果強烈提示，在骨髓瘤細(xì)胞中，UPR與自噬反應(yīng)的調(diào)控過程相互依賴。
　　為了進(jìn)一步探討硼替佐米是否造成UPR信號紊亂失衡，我們以不同方式處理細(xì)胞后，我們采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測靶細(xì)胞凋亡率；采用Westernblot檢測靶細(xì)胞UPR相關(guān)

7、蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明：(1)經(jīng)硼替佐米、BFA和Tg處理不同時間后，靶細(xì)胞凋亡率及UPR相關(guān)蛋白的表達(dá)均呈時間依賴性增加；(2)硼替佐米能干擾BFA或Tg誘導(dǎo)的XBP-1s、XBP-1u及BiP蛋白的表達(dá)，但卻促進(jìn)BFA或Tg誘導(dǎo)的CHOP蛋白的表達(dá)，提示硼替佐米可以引起UPR反應(yīng)中保護(hù)信號的表達(dá)與信號輸出的紊亂失衡。
　　為了探討硼替佐米是否影響自噬過程，我們以不同方式處理細(xì)胞后，采用電鏡技術(shù)檢測自噬體/自噬溶酶體；采用West

8、ernblot檢測靶細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，采用免疫共沉淀檢測Beclin-1-PI3KC3復(fù)合物的形成。結(jié)果表明：(1)硼替佐米處理H929細(xì)胞24小時后電鏡檢測未發(fā)現(xiàn)有經(jīng)典自噬體/自噬溶酶體形成；(2)硼替佐米分別處理H929和RPMI8226細(xì)胞不同時間后，靶細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)呈時間依賴性減少；(3)硼替佐米可以干擾自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素誘發(fā)的自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)；(4)硼替佐米可以抑制Beclin-1-PI3KC3復(fù)合物的形成；(

9、5)活化自噬可以降低硼替佐米的促骨髓瘤細(xì)胞凋亡活性，抑制自噬對其活性無明顯影響。提示，硼替佐米除了干擾UPR、促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞凋亡外，尚抑制骨髓瘤細(xì)胞內(nèi)源性自噬反應(yīng)，從而進(jìn)一步消除了自噬對骨髓瘤細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　結(jié)論：1.骨髓瘤細(xì)胞中自噬與未折迭蛋白反應(yīng)的調(diào)控過程密切關(guān)聯(lián)；2.蛋白酶體抑制劑硼替佐米雖能誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，但卻干擾了未折迭蛋白反應(yīng)，致使其保護(hù)性成分BiP和XBP-1與促凋亡成份CHOP表達(dá)紊亂失衡，進(jìn)而觸發(fā)