蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元自噬功能變化和GDNF保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、帕金森病(PD)是一種中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，病理特征主要表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元的丟失和路易小體(LB)的形成。臨床上表現(xiàn)為肌強(qiáng)直、靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩及姿勢(shì)步態(tài)異常等。PD的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，許多證據(jù)顯示，泛素—蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)功能異常導(dǎo)致蛋白質(zhì)異常聚集，是PD發(fā)病的共同病理生理學(xué)基礎(chǔ)；用蛋白酶體抑制劑建立的細(xì)胞和動(dòng)物模型更能體現(xiàn)PD的病理學(xué)特征，對(duì)于篩選和驗(yàn)證PD的治療藥物具有重要意義。自噬是異常蛋白

2、質(zhì)降解的另一條重要的途徑，已知研究顯示UPS功能障礙可以使自噬功能增強(qiáng)，但是在DA神經(jīng)元內(nèi)，關(guān)于這種自噬功能增強(qiáng)的機(jī)制以及病理生理學(xué)意義，目前尚不清楚。本研究探討了UPS功能障礙誘導(dǎo)自噬功能增強(qiáng)的機(jī)制，以及對(duì)DA神經(jīng)元存活的意義；膠質(zhì)源性神經(jīng)生長因子(GDNF)對(duì)于UPS功能障礙引起的DA神經(jīng)元變性和包涵體形成的保護(hù)治療效果及可能的作用機(jī)制。文章分為兩個(gè)部分： 第一部分：UPS功能障礙誘導(dǎo)自噬功能變化機(jī)制及病理生理學(xué)意義的探討。

3、以蛋白酶體抑制劑lactacystin處理的腹側(cè)中腦(VM)神經(jīng)元和SH-SY5Y細(xì)胞為細(xì)胞模型。首先，利用Western印跡法、電鏡、Realtime-PCR和免疫組化等方法檢測(cè)UPS功能障礙對(duì)自噬以及p53 mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響。其次，通過提前使用p53抑制劑pifithrin-α(PFT-α)及p53 RNA干擾(RNAi)等技術(shù)，抑制p53表達(dá)，觀察對(duì)lactacystin誘導(dǎo)的自噬水平的影響；之后，利用自噬抑制劑3-甲

4、基腺嘌呤(3-MA)或RNAi等技術(shù)抑制自噬相關(guān)基因Beclin1的表達(dá)，或者使用自噬增強(qiáng)劑雷帕霉素(RA)增強(qiáng)自噬，觀察對(duì)p53及線粒體相關(guān)凋亡通路的影響；最后，利用RA預(yù)處理原代VM神經(jīng)元，進(jìn)一步激活自噬，觀察能否對(duì)UPS功能障礙引起的DA神經(jīng)元變性起到神經(jīng)保護(hù)作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UPS功能障礙可以增強(qiáng)DA神經(jīng)元內(nèi)自噬水平，增高p53表達(dá)水平；而抑制p53表達(dá)，則減弱UPS功能障礙介導(dǎo)的自噬功能增強(qiáng)，增加α-共核蛋白聚集水平。提前抑

5、制自噬功能，可以部分阻斷UPS功能障礙誘導(dǎo)激活的p53及線粒體相關(guān)凋亡通路；而提前增強(qiáng)自噬，具有相反的作用。RA預(yù)處理部分改善UPS功能障礙產(chǎn)生的神經(jīng)元毒性作用，對(duì)DA神經(jīng)元起到保護(hù)作用，這種保護(hù)作用與增強(qiáng)α-共核蛋白降解有關(guān)。這部分研究結(jié)果表明，p53部分地介導(dǎo)了UPS功能障礙誘導(dǎo)的自噬功能增強(qiáng)，這種增強(qiáng)的自噬，反過來，部分抑制p53及線粒體相關(guān)凋亡通路，在一定程度上，有利于DA神經(jīng)元的存活；利用RA進(jìn)一步增強(qiáng)自噬，可以保護(hù)UPS功能

6、障礙的VM神經(jīng)元模型，其保護(hù)機(jī)制與增強(qiáng)異常蛋白隆解，抑制p53和下游線粒體相關(guān)凋亡通路有關(guān)，提示RA在PD發(fā)病中具有潛在的保護(hù)治療作用。 第二部分：GDNF對(duì)UPS功能障礙小鼠模型治療作用的研究。采用單側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束(MFB)立體定位注射lactacystin，建立UPS功能障礙的C57BL小鼠模型，注射后1w，部分小鼠通過紋狀體微泵注射，給予GDNF0.48μg/d，持續(xù)2w，之后收集標(biāo)本行相關(guān)檢測(cè)。首先，通過Western印跡

7、法、高效液相色譜分析等方法檢測(cè)GDNF的保護(hù)治療效果：其次，分析GDNF的保護(hù)治療作用與影響絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)及AKT通路的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，lactacystin注射后3w可以明顯損傷DA神經(jīng)元，減少紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物的水平，而微泵持續(xù)注射GDNF2w，可以增加31％黑質(zhì)DA神經(jīng)元數(shù)目，以及40％的紋狀體DA水平。Lactacystin誘導(dǎo)DA神經(jīng)元變性與促進(jìn)c-Jun氨基端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ER