修飾未折疊蛋白反應(yīng)誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種漿細(xì)胞惡性腫瘤，以骨髓中異常漿細(xì)胞惡性增殖、分泌單克隆免疫球蛋白、正常免疫球蛋白受到抑制以及溶骨病變?yōu)樘卣?。發(fā)生率占血液系統(tǒng)腫瘤的10％，占所有腫瘤的1％，死亡率占所有腫瘤的2％。美國癌癥學(xué)會統(tǒng)計表明，2009年美國MM的新發(fā)病例約為20,580，包括男性患者11,680例，女性患者8900例，死亡約10,580例，MM發(fā)病率僅次于非霍奇金淋巴瘤，成為血液系統(tǒng)的第二位常見的惡性

2、腫瘤。在我國也呈逐年升高的趨勢。MM的治療主要包括傳統(tǒng)化療，造血干細(xì)胞移植以及新藥治療。目前，新的靶向治療藥物已經(jīng)成為治療MM的重要手段，但就目前而言，骨髓瘤仍是不可治愈的疾病。維甲酸在誘導(dǎo)分化治療急性早幼粒細(xì)胞白血病領(lǐng)域取得的巨大成功，鼓舞人們進(jìn)行深入研究腫瘤的分化治療策略。但在誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞分化方面其作用機(jī)制尚未完全闡明。因此，需要對其分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)一步研究，以便為臨床新藥的開發(fā)與使用提供理論依據(jù)，進(jìn)而制定新的聯(lián)合用藥方案，提高臨

3、床療效。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是真核細(xì)胞中負(fù)責(zé)分泌性蛋白折疊和組裝的細(xì)胞器。當(dāng)細(xì)胞在病原感染、化學(xué)損傷、遺傳突變、營養(yǎng)剝奪，以及正常分化(如B細(xì)胞分化)等各種內(nèi)外源因素刺激下，ER中未折疊或錯誤折疊的蛋白增多，出現(xiàn)ER應(yīng)激(ER stress)，應(yīng)激信號能通過ER膜傳遞到細(xì)胞核中，繼而引起一系列特定的靶基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)和蛋白質(zhì)翻譯水平下調(diào)，以使細(xì)胞能繼續(xù)存活，這種反應(yīng)就是未折疊蛋白反應(yīng)(u

4、nfolded protein response，UPR)。MM細(xì)胞是漿細(xì)胞克隆增生性腫瘤，同正常漿細(xì)胞一樣，骨髓瘤細(xì)胞具有高度發(fā)達(dá)和擴(kuò)張的粗面ER，每秒鐘能產(chǎn)生成千上萬個免疫球蛋白分子，大量的免疫球蛋白在分泌之前必須經(jīng)過ER的正確折疊和組裝。如果這些蛋白不能被正確折疊，就會出現(xiàn)ER應(yīng)激，誘導(dǎo)UPR的產(chǎn)生。漿細(xì)胞通過UPR減少免疫球蛋白分子的翻譯，增加ER伴侶分子GRP78(glucose regulatingprotein78)和GR

5、P94(glucose regulating protein94)以及折疊酶的表達(dá)，增強(qiáng)ER相關(guān)蛋白質(zhì)降解途徑(ER-associated degradation，ERAD)活性，提高細(xì)胞處理未折疊蛋白的能力，使之存活。
　　 目前研究顯示ER膜上有3種跨膜蛋白感應(yīng)ER應(yīng)激：PERK(PKR-like ER kinase)、ATF6(activating transcription factor-6)以及具有激酶和核酸內(nèi)切酶活性

6、的IRE1(inositol-requiring enzyme1)?；罨蟮腎RE1具有核酸內(nèi)切酶活性，對XBP-1 mRNA進(jìn)行剪接形成376aa的XBP-1剪接蛋白(XBP-1s)；未經(jīng)剪接的XBP-1 mRNA則形成261aa的蛋白(XBP-1u)。XBP-1是具有b-zip結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，大量證據(jù)表明XBP-1對B細(xì)胞分化成熟為漿細(xì)胞，并分泌免疫球蛋白是至關(guān)重要的，為漿細(xì)胞分化所必需。XBP-1-/-的B淋巴細(xì)胞胞漿中可以表達(dá)免

7、疫球蛋白，但不能大量的分泌免疫球蛋白，也不能完成B淋巴細(xì)胞的最終分化過程；在XBP-1-/-的B淋巴細(xì)胞中經(jīng)基因轉(zhuǎn)染后重新表達(dá)XBP-1 mRNA，可以有效地恢復(fù)免疫球蛋白的分泌。因此，XBP-1在UPR時表達(dá)上調(diào)，是UPR的關(guān)鍵靶基因，也對漿細(xì)胞的成熟、分化具有重要意義。
　　 目前研究顯示UPR在正常B細(xì)胞向漿細(xì)胞的分化過程中起重要的作用，沒有UPR，漿細(xì)胞不能完成最終的分化和分泌免疫球蛋白。XBP-1在UPR活化時表達(dá)上調(diào)

8、，并增加UPR靶基因伴侶分子GRP78和GRP94的表達(dá)，調(diào)節(jié)UPR。XBP-1也是UPR反應(yīng)元件中與漿細(xì)胞分化相關(guān)的唯一轉(zhuǎn)錄因子。
　　 當(dāng)前研究國際上對誘導(dǎo)分化治療MM研究甚少，尤其通過修飾未折疊蛋白反應(yīng)誘導(dǎo)MM分化還是空白。因此，我們設(shè)想通過UPR的經(jīng)典誘導(dǎo)劑二硫蘇糖醇(DTT)或衣霉素(tunicamycin)誘導(dǎo)MM細(xì)胞發(fā)生UPR，觀察對MM細(xì)胞分化的影響，研究XBP-1u、XBP-1s以及下游的伴侶分子GRP78、G

9、RP94等的表達(dá)，然后采用RNAi等技術(shù)，影響XBP-1u、XBP-1s等的表達(dá)修飾UPR，最終達(dá)到明確誘導(dǎo)MM細(xì)胞分化的機(jī)制。本實驗研究包括以下三個部分：
　　 第一部分、小劑量UPR誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞分化的實驗研究
　　 目的:探討小劑量UPR誘導(dǎo)劑對骨髓瘤細(xì)胞的分化作用。
　　 方法:用小劑量UPR誘導(dǎo)劑(TM，DTT)處理MM細(xì)胞株U266，RPMI-8226。Annix V檢測細(xì)胞的凋亡率。經(jīng)細(xì)胞涂片

10、，瑞氏染色后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；流式檢測檢測細(xì)胞表面CD49e的表達(dá)率；用人λ輕鏈ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中輕鏈蛋白的濃度。
　　 結(jié)果:UPR誘導(dǎo)劑TM0.4μmol/L，DTT0.5mmol/L處理骨髓瘤細(xì)胞株U266，RPMI-822672小時后，Annix V檢測細(xì)胞的凋亡率均低于5％。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與對照組相比即可見到細(xì)胞胞核縮小，胞漿豐富，核漿比例下降，核仁減少或消失，核染色質(zhì)變粗、變密。有些細(xì)胞具有典

11、型的堿性胞漿，胞漿豐富，出現(xiàn)胞核偏心，核染色質(zhì)粗糙，凝聚成塊狀，著色深，排列成車輪狀，，呈現(xiàn)成熟漿細(xì)胞特有的形態(tài)改變，有別于細(xì)胞凋亡的早期形態(tài)學(xué)改變。
　　 U266細(xì)胞CD49e的陽性率在對照組8.61±0.82％，TM處理72h后，U266細(xì)胞CD49e的陽性率為43.15±3.78％，有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)，DTT處理72h后CD49e的陽性率為38.08±2.9％，有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)。 RPMI-8226

12、細(xì)胞CD49e的陽性率對照4.89±0.37％，TM處理72h后，CD49e的陽性率為25.54±2.67％，有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)；DTT處理72h后CD49e的陽性率為11.83±1.38％(p＜0.05)。
　　 U266細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中輕鏈蛋白的濃度，對照組456.25±19.07ng/ml，TM處理72h組，692.35±45.4ng/ml，有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)，DTT處理72h后，輕鏈蛋白的濃度為61

13、4.42±22.67ng/ml,有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。
　　 RPMI-8226細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中輕鏈蛋白的濃度，對照組292.24±23.59ng/ml，TM處理72h組，407.16±18.09，有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.01)，DTT處理72h后，輕鏈蛋白的濃度為478.35±15.37g/ml,有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。
　　 在原代細(xì)胞經(jīng)UPR誘導(dǎo)劑處理72小時后，也得到有類似的結(jié)果，細(xì)胞具有形態(tài)學(xué)分化

14、的表現(xiàn)，CD49e細(xì)胞的陽性率增加，培養(yǎng)上清液中輕鏈蛋白的濃度增加。
　　 結(jié)論:小劑量UPR誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞株和原代細(xì)胞進(jìn)一步的分化。
　　 第二部分、UPR誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞分化過程中相關(guān)基因表達(dá)情況的研究
　　 目的:研究小劑量UPR誘導(dǎo)劑(TM，DTT)在誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞分化過程中，未折蛋白反應(yīng)相關(guān)基因GRP78,GRP94的轉(zhuǎn)錄水平變化，與UPR和B細(xì)胞分化密切相關(guān)的XBP-1u,XBP-1s在

15、轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平的變化。
　　 方法:小劑量UPR誘導(dǎo)劑(TM，DTT)處理骨髓瘤細(xì)胞株U266,RPMI-8226，熒光Realtime PCR檢測基因GRP78，GRP94，XBP-1u,，XBP-1s的轉(zhuǎn)錄水平變化，Western Blot檢測XBP-1u，XBP-1s蛋白翻譯水平的變化。
　　 結(jié)果:小劑量UPR誘導(dǎo)劑(TM，DTT)處理骨髓瘤細(xì)胞株U266,RPMI-8226后與對照組相比，熒光Realtim

16、e PCR檢測基因GRP78，GRP94，XBP-1u,的轉(zhuǎn)錄水平是明顯上調(diào)的，上調(diào)水平約1.5～3.12倍，而XBP-1s的轉(zhuǎn)錄水平是下降的。Western Blot檢測XBP-1u的翻譯水平是相對增加的，而XBP-1s的蛋白翻譯水平下調(diào)。
　　 結(jié)論:在骨髓瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程中發(fā)生了未折疊蛋白反應(yīng)，XBP-1u的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平是相對增加的。
　　 第三部分、調(diào)控基因XBP-1u/XBP-1s表達(dá)對骨髓瘤細(xì)胞分化的影

17、響
　　 目的:研究基因XBP-1u/XBP-1s表達(dá)水平的差異對骨髓瘤細(xì)胞分化的影響。
　　 方法:分別采用siRNA沉默XBP-1u的表達(dá)，構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞過表達(dá)基因XBP-1u和XBP-1s后，通過形態(tài)學(xué)觀察，流式檢測細(xì)胞表面CD49e的表達(dá)率，和ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)上清中輕鏈蛋白的含量。
　　 結(jié)果:采用siRNA沉默XBP-1u的表達(dá)后，骨髓瘤細(xì)胞的進(jìn)一步分化被阻斷；過表達(dá)XBP-1u可