未折疊蛋白反應(yīng)對(duì)化療藥物誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　1、探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　2、檢測(cè)順鉑(cisplatin，CDDP)、阿霉素(adriamycin,ADR)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞及C3H小鼠移植性乳腺癌ERS的激活作用以及對(duì)Caspase-4/Caspase-12介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的影響。
　　3、探討利用SiRNA干擾技術(shù)阻斷UPR，對(duì)CDDP和ADR所致

2、MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：
　　一、體外實(shí)驗(yàn)：
　　1、用衣霉素(Tunicamycin,TM)(3μmol/L)、CDDP(10 mg/L)、ADR(1mg/L)，處理MDA-MB-231細(xì)胞不同時(shí)間(0、6、12、24、36 h),Western blot檢測(cè)葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78，GRP78)的表達(dá)。
　　2、用CDDP、ADR處理M

3、DA-MB-231細(xì)胞48 h后，用溴化丙啶(propidium iodide， PI)染色，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　3、用CDDP、ADR處理MDA-MB-231細(xì)胞不同時(shí)間(0、6、12、24、36 h)，按Caspase-4活性檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明收集細(xì)胞并檢測(cè)Caspase-4活性。
　　4、SiRNA干擾GRP78合成阻斷UPR，再用CDDP、ADR處理MDA-MB-231細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和Ca

4、spase-4活性的改變。
　　二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　1、C3H小鼠自發(fā)性乳腺癌為瘤源制成細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞濃度為2×107/ml接種于無(wú)瘤C3H小鼠，隨機(jī)分組。第9天起，每組分別給予生理鹽水NS、ADR、CDDP腹腔注射，每3天給藥一次，每3天測(cè)量腫瘤長(zhǎng)短徑1次，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，第21天處死小鼠，稱量腫瘤重量，計(jì)算抑瘤率。
　　2、取腫瘤組織，提取蛋白，定量后Western blot檢測(cè)GRP78及Caspase-12的

5、表達(dá)。
　　3、腫瘤組織做常規(guī)石蠟包埋、切片并做HE染色，置顯微鏡下觀察其病理表現(xiàn)。
　　4、腫瘤組織用免疫組化法檢測(cè)處理組與非處理組中GRP78的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　一、體外試驗(yàn)
　　1、CDDP和ADR對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中GRP78表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響。
　　（1）CDDP和ADR上調(diào)GRP78的表達(dá)（P﹤0.01）。
　?。?）CDDP和ADR誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，

6、凋亡率﹤30％。
　?。?）CDDP和ADR對(duì)Caspase-4的誘導(dǎo)呈先上升后下降的趨勢(shì)，而對(duì)GRP78的誘導(dǎo)則呈線性上升趨勢(shì)。
　　2、SiRNA干擾GRP78的合成對(duì)CDDP、ADR誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響。
　?。?）GRP78SiRNA轉(zhuǎn)染，增加CDDP和ADR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率（P﹤0.01）。
　?。?）GRP78SiRNA轉(zhuǎn)染增加Caspase-4的活性，取消Caspase-4活性的下

7、降相，并使其呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)。
　　二、體內(nèi)試驗(yàn)
　　1、CDDP和ADR對(duì)C3H小鼠移植性乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，第21天測(cè)量移植腫瘤體積分別為：NS組1690.89±42.94 mm3，CDDP組549.78±20.87 mm3，ADR組750.18±64.64 mm3。與NS組比較，CDDP組和ADR組腫瘤體積明顯減小，抑瘤率分別為60.48%、58.55%（P﹤0.01）。
　　2、HE染色組織病理

8、學(xué)檢查顯示CDDP組、ADR組細(xì)胞大小不一，核質(zhì)深染，可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死灶及大片的無(wú)結(jié)構(gòu)紅染壞死表現(xiàn)。
　　3、免疫組化結(jié)果顯示，CDDP組和ADR組中GRP78表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性，NS組中表達(dá)較弱。
　　4、腫瘤組織提取蛋白Western blot檢測(cè)GRP78表達(dá)，與NS組比較，CDDP組和ADR組GRP78表達(dá)明顯增強(qiáng)（P﹤0.01）。檢測(cè)Caspase-12的表達(dá)，與NS組比較，CDDP組和ADR組Caspase-12表達(dá)明顯

9、減弱（P﹤0.01）。
　　5、Caspase-12的Western blotting結(jié)果顯示CDDP和ADR處理組動(dòng)物腫組織的Caspase-12的表達(dá)明顯降低（P﹤0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、CDDP、ADR體外可誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞，體內(nèi)可誘導(dǎo)C3H小鼠移植性乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生ERS、UPR和GRP78的高表達(dá)。
　　2、干擾腫瘤細(xì)胞GRP78的表達(dá)可增強(qiáng)CDDP、ADR的抗腫瘤作用。二者聯(lián)用可上