FXR1P蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的鑒定及相關(guān)小分子RNA的篩選.pdf

1、脆性 X綜合征是最常見的遺傳性智力低下疾病之一,由 FMR1編碼產(chǎn)物FMRP的表達下降或缺失引發(fā)疾病。FXR1與FMR1有高度的序列及結(jié)構(gòu)相似性,屬于脆性X基因家族。FXR1編碼產(chǎn)物FXR1P與FMRP在氨基酸序列上具有極高的同源性,屬于脆性X蛋白家族。FXR1P是一種對于神經(jīng)和肌肉系統(tǒng)發(fā)育有重要調(diào)控作用的蛋白,具有RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合功能。FXR1P蛋白及RNAs結(jié)合特性研究在一定程度上有助于了解FXR1P的調(diào)節(jié)機制及其基本功能,進而明

2、確FXR1P與脆性X綜合征發(fā)病機制的關(guān)系。
　　目的:1用FXR1P與CMAS這對經(jīng)驗證有相互作用蛋白質(zhì),對FXR1P分子內(nèi)的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域進行鑒定,研究FXR1P的蛋白結(jié)合特性,揭示FXR1P與蛋白質(zhì)相互作用的分子機制。2對人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞中的FXR1P與小分子RNA結(jié)合情況進行研究,篩選可與FXR1P相互作用的小分子RNAs,鑒定其種類,探索 FXR1P與小分子RNAs之間的關(guān)系,揭示 FXR1P調(diào)節(jié)目標mRN

3、A的分子機制。
　　方法:1利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在線分析工具 PDB數(shù)據(jù)庫,對 FXR1P分子進行分析,預(yù)測FXR1P的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域,設(shè)計引物擴增可表達包含不同結(jié)構(gòu)域FXR1P分子的基因,產(chǎn)物構(gòu)建到pGBKT7載體,酵母雙雜交鑒定表達產(chǎn)物與CMAS的相互作用情況,確定相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。2利用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù),在人神經(jīng)母細胞瘤 SH-SY5Y細胞中篩選與 FXR1P有相互作用的小分子RNAs,3'和5'端加特定接頭后逆轉(zhuǎn)錄

4、為cDNA單鏈,設(shè)計引物進行PCR擴增,回收PCR產(chǎn)物后連接至T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑取陽性克隆測序,生物信息學分析確定小分子RNA種類。
　　結(jié)果:1成功構(gòu)建了pGBKT7-FXR1Δ402和pGBKT7-FXR1Δ450兩種表達不同N端FXR1P的重組質(zhì)粒,經(jīng)檢測無自激活性;酵母雙雜交結(jié)果顯示,FXR1P N端第134–150之間的17個氨基酸殘基是與CMAS相互作用的關(guān)鍵區(qū)域;2利用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù),從SH