Y盒結合蛋白-1C末端結構域調節(jié)血管新生的機制研究.pdf

1、目的：近年來，乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，發(fā)病率居于女性惡性腫瘤的首位，對世界女性健康造成嚴重威脅。血管新生過程是腫瘤的增殖、侵襲、轉移的關鍵環(huán)節(jié)，抗血管新生治療也廣泛應用于臨床，抗血管生成藥物日新月異。Y盒結合蛋-1（Y-box binding protein-1，YB-1）作為體內(nèi)重要的轉錄因子，在包括基因轉錄、RNA剪切及mRNA翻譯、DNA修復、細胞增殖等多個過程中均發(fā)揮重要作用，并在肺癌、結腸癌、胃癌等多種惡性腫瘤中表達，并與腫

2、瘤增殖、耐藥密切相關，且有研究表明其可調節(jié)血管內(nèi)皮細胞的增殖，但其調節(jié)腫瘤血管新生的機制有待進一步研究。本研究通過構建腺病毒表達載體，并用腺病毒液感染EA.hy926內(nèi)皮細胞旨在探究冷休克蛋白家族成員YB-1蛋白C末端結構域（YB-1 C-terminal domain，YB-1 CTD）對血管新生的調節(jié)機制，為抗血管新生靶向治療提供理論依據(jù)。
　　方法：構建腺病毒表達載體，用GFP和GFP-YB-1 CTD腺病毒液感染EA.hy

3、926內(nèi)皮細胞，MTS法檢測GFP和GFP-YB-1 CTD對細胞增殖的影響；流式細胞術PI染色檢測YB-1 CTD對細胞周期的影響；Western blot檢測YB-1 CTD對EA.hy926細胞周期相關蛋白p21、cyclin B1的表達水平的調節(jié)；RT-PCR檢測YB-1 CTD對p21、cyclin B1 mRNA表達的影響；跨膜遷移實驗評價YB-1 CTD對EA.hy926內(nèi)皮細胞遷移能力的影響；血管內(nèi)皮成環(huán)實驗檢測YB-1

4、 CTD對EA.hy926內(nèi)皮細胞血管成環(huán)特性的影響；ELISA檢測YB-1CTD對SK-BR-3乳腺癌細胞分泌VEGF的調節(jié)；檢測細胞骨架染色觀察YB-1CTD對EA.hy926內(nèi)皮細胞細胞骨架的分布及狀態(tài)的影響。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（(x)± s）表示，應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行處理，均數(shù)比較采用t檢驗或單因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果： MTS法檢測細胞增殖顯

5、示，轉染GFP-YB-1 CTD48小時后，EA.hy926內(nèi)皮細胞和SK-BR-3乳腺癌細胞增殖均受到抑制；流式細胞術PI染色檢測細胞周期結果提示YB-1 CTD可調節(jié)EA.hy926細胞周期阻滯在G1期；Western blot免疫印跡分析顯示與GFP對照組相比，GFP-YB-1 CTD能上調EA.hy926內(nèi)皮細胞中p21蛋白的表達水平，并下調cyclin B1蛋白的表達水平；實時定量PCR結果提示，在mRNA水平，YB-1CTD

6、促進p21的表達，而抑制cyclin B1的表達；跨膜遷移實驗可見GFP組較GFP-YB-1 CTD組跨膜遷移的細胞數(shù)多；鬼筆環(huán)肽細胞骨架染色觀察到GFP組EA.hy926內(nèi)皮細胞中含有大量平行束狀分布的應力纖維，且纖維粗大，沿細胞長軸分布，GFP-YB-1 CTD組，未見明顯的纖維束，微絲解聚并且彌散地分布于胞質中，血管內(nèi)皮成環(huán)實驗結果顯示，在40倍顯微鏡下，GFP組血管內(nèi)皮成環(huán)數(shù)量多，血管環(huán)完整，在Metrigel膠表面較均勻分布，

7、延長培養(yǎng)時間血管環(huán)穩(wěn)定，不易破碎，GFP-YB-1 CTD組內(nèi)皮細胞不易成環(huán)，或者部分成環(huán)，血管環(huán)不完整，成條索狀結構；在100倍顯微鏡下觀察GFP組能明顯觀察到EA.hy926血管內(nèi)皮細胞伸展、延長，相鄰的細胞可以連接呈環(huán)狀。GFP-YB-1 CTD組EA.hy926血管內(nèi)皮細胞部分伸展，部分呈球狀，僅有少數(shù)細胞可以產(chǎn)生相互連接，形成類似于“肝索”樣的細胞條索，而不是完整的血管環(huán)。ELISA法檢測SK-BR-3細胞條件培養(yǎng)基中的VEG

8、F含量結果顯示，與GFP對照組相比，GFP-YB-1 CTD組條件培養(yǎng)基中VEGF含量低。SK-BR-3細胞條件培養(yǎng)基刺激條件下的血管成環(huán)結果顯示，GFP組血管內(nèi)皮成環(huán)數(shù)量多、血管環(huán)完整、周長較長，延長培養(yǎng)時間，血管環(huán)穩(wěn)定，GFP-YB-1 CTD組內(nèi)皮幾乎不成環(huán)或者少數(shù)成環(huán)，成環(huán)局限、不完整且不穩(wěn)定易破碎。
　　結論： YB-1 CTD抑制EA.hy926內(nèi)皮細胞及SK-BR-3乳腺癌細胞增殖，影響EA.hy926遷移和成環(huán)能力