果蠅GABAB受體C末端Coiled–Coil結(jié)構(gòu)域復(fù)合物的表達、純化與結(jié)晶.pdf

1、代謝型GABAB受體是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ–氨基丁酸的受體，它位于細胞質(zhì)膜上，屬于C家族G蛋白偶聯(lián)受體，其拓撲結(jié)構(gòu)包含N端保外區(qū)、跨膜區(qū)、C端胞內(nèi)區(qū)。人源功能性GABAB受體由GB1與GB2亞基組成異源二聚體復(fù)合物，GB1亞基負責結(jié)合配體、GB2亞基負責偶聯(lián)G蛋白而開啟下游信號通路。GB2亞基可以單獨于細胞內(nèi)上膜表達，GB1亞基C末端含有一段內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列，阻止了其單獨上膜表達。但是GB1與GB2亞基共同于細胞中表達時

2、，它們的C末端能夠形成具有強烈相互作用的Coiled– Coil超二級結(jié)構(gòu)，從而屏蔽了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號對GB1亞基的影響，使得GB1&GB2異源二聚體能夠正常上膜表達并行使生理功能。
　　與人源不同的是，果蠅 GABAB受體有 DGB1，DGB2，DGB3三個亞型，其中已知DGB1與DGB2能夠組成異源二聚體復(fù)合物，DGB3亞基的生理功能尚不清楚。本文首先針對果蠅GABAB受體DGB1與DGB2亞基C末端氨基酸序列利用生物信息學手段

3、進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)存在可能形成α螺旋的區(qū)域。之后根據(jù)人與果蠅GABAB受體C末端序列比對的結(jié)果，并參考已有文獻報道的人源GABAB受體C末端Coiled– Coil結(jié)構(gòu)域復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，設(shè)計了6組可能存在相互作用的氨基酸序列，全部分別構(gòu)建至His和GST標簽的表達載體中，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)進行初步的表達與純化。利用純化得到的蛋白，接下來通過GST–Pull Down實驗確定了兩個亞基的C末端存在相互作用的氨基酸序列范圍。最