轉(zhuǎn)錄因子C-EBPβ功能結(jié)構(gòu)域LIP原核表達(dá)、純化與功能探討.pdf

1、基因表達(dá)是遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，可以在不同的水平上進(jìn)行調(diào)控。其中，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是表達(dá)水平調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。C/EBPs(CCAATenhancer binding proteins)是一類(lèi)與DNA增強(qiáng)子區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子家族，C/EBPβ是該家族的一個(gè)重要成員，其C端具有高度保守的DNA結(jié)合域和二聚化功能域。它主要通過(guò)對(duì)靶細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞增殖與分化、腫瘤發(fā)生與凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等重要生命活動(dòng)。C/EB

2、Pβ的異構(gòu)體之一LIP不具有N端的激活功能域，只有C端的DNA結(jié)合域。在體外，野生型的LIPwt的DNA結(jié)合能力很低，而其突變體LIPM(Thr179/188Asp)卻具有很強(qiáng)的DNA結(jié)合能力，其機(jī)制目前還沒(méi)有報(bào)道。為了研究LIPwt和LIPM與DNA結(jié)合能力的差異，我們計(jì)劃用NMR技術(shù)來(lái)研究其相關(guān)的復(fù)合物三維溶液結(jié)構(gòu)，以期解釋其機(jī)理。本論文工作側(cè)重于前期的蛋白質(zhì)制備與初步的功能研究，主要內(nèi)容分為兩部分：
　　 (1)LIPwt

3、和LIPM蛋白樣品制備與純化：利用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建了含SUMO標(biāo)簽的pSMT3/LIPwt和pSMT3/LIPM重組表達(dá)質(zhì)粒。將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌Rossetta(DE3)中，從誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG的濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等方面對(duì)目的蛋白可溶性表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。為了獲得大量而穩(wěn)定的目的蛋白，在純化蛋白時(shí)，進(jìn)行了緩沖液、不同層析方法的篩選，解決了蛋白穩(wěn)定性差的問(wèn)題。目的蛋白經(jīng)過(guò)親和鎳柱、CM離子交換柱和凝膠過(guò)濾色譜純化，最終得到了符合