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文檔簡介
1、基因表達(dá)是遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程,可以在不同的水平上進(jìn)行調(diào)控。其中,轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是表達(dá)水平調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié),也是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。C/EBPs(CCAATenhancer binding proteins)是一類與DNA增強(qiáng)子區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子家族,C/EBPβ是該家族的一個重要成員,其C端具有高度保守的DNA結(jié)合域和二聚化功能域。它主要通過對靶細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié),參與細(xì)胞增殖與分化、腫瘤發(fā)生與凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等重要生命活動。C/EB
2、Pβ的異構(gòu)體之一LIP不具有N端的激活功能域,只有C端的DNA結(jié)合域。在體外,野生型的LIPwt的DNA結(jié)合能力很低,而其突變體LIPM(Thr179/188Asp)卻具有很強(qiáng)的DNA結(jié)合能力,其機(jī)制目前還沒有報道。為了研究LIPwt和LIPM與DNA結(jié)合能力的差異,我們計劃用NMR技術(shù)來研究其相關(guān)的復(fù)合物三維溶液結(jié)構(gòu),以期解釋其機(jī)理。本論文工作側(cè)重于前期的蛋白質(zhì)制備與初步的功能研究,主要內(nèi)容分為兩部分:
(1)LIPwt
3、和LIPM蛋白樣品制備與純化:利用分子克隆技術(shù),構(gòu)建了含SUMO標(biāo)簽的pSMT3/LIPwt和pSMT3/LIPM重組表達(dá)質(zhì)粒。將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌Rossetta(DE3)中,從誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG的濃度和誘導(dǎo)時間等方面對目的蛋白可溶性表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。為了獲得大量而穩(wěn)定的目的蛋白,在純化蛋白時,進(jìn)行了緩沖液、不同層析方法的篩選,解決了蛋白穩(wěn)定性差的問題。目的蛋白經(jīng)過親和鎳柱、CM離子交換柱和凝膠過濾色譜純化,最終得到了符合
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