捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)Hc38基因保守結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)及基于RNAi的功能初步研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)（Haemonchuscontortus）屬毛圓科（Triehostrongylidae）血矛屬（Haemonchus）線蟲(chóng)，分布較廣。寄生于反芻動(dòng)物第四胃和小腸，因吸血可導(dǎo)致宿主貧血和衰弱，引起幼齡動(dòng)物，尤其是羔羊死亡，對(duì)畜收業(yè)造成極大經(jīng)濟(jì)損失。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病傳統(tǒng)的防治方法是使用化學(xué)驅(qū)蟲(chóng)藥并結(jié)合定期轉(zhuǎn)場(chǎng)管理，但隨著耐藥蟲(chóng)株的出現(xiàn)和蔓延，以及嚴(yán)重的藥物殘留問(wèn)題，傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法受到了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。這已經(jīng)迫使人們將注意力轉(zhuǎn)移到

2、利用免疫學(xué)方法來(lái)防治該病，尤其是疫苗的開(kāi)發(fā)上。
　　Hc38基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)腸上皮微絨毛上呈高豐度表達(dá)，據(jù)推測(cè)它的表達(dá)產(chǎn)物是一種重要的功能蛋白。該基因表達(dá)產(chǎn)物的196-512位氨基酸構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域?qū)儆诠δ芪粗牡鞍准易錺f04910，該家族目前有251條蛋白序列登錄在GeneBank上，它們分屬于194種生物，其中的45種為人類或動(dòng)物的重大血源性疫病病原或傳播媒介。GeneBank公布了該抗原基因的全序列，然而其功能國(guó)內(nèi)外尚無(wú)

3、相關(guān)報(bào)道。為此，作者開(kāi)展了以下研究：
　　1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)Hc38基因保守結(jié)構(gòu)域的克隆、原核表達(dá)與分析
　　參照GenBank中發(fā)布的Hc38基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出Hc38基因的保守結(jié)構(gòu)域序列，命名為HcP，將其克隆到表達(dá)載體pET32a中，并將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)免疫親和層析柱純化后用SDS-PAGE和Westernblot進(jìn)行檢測(cè)并用弗氏佐劑制成疫苗免疫小鼠，每只小鼠免

4、疫100μg蛋白，每隔10d免疫一次，四免后采血，ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)。結(jié)果表明，擴(kuò)增出的片段大小與預(yù)期一致，與參考序列的相似性達(dá)99.34％，說(shuō)明HcP基因成功克隆，HcP基因在大腸桿菌中高效表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白分子量約為49.4kd，且純化后的表達(dá)產(chǎn)物能與感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的山羊血清產(chǎn)生單一的免疫印記條帶，具有良好的反應(yīng)原性，純化產(chǎn)物免疫小鼠4次后，血清最高效價(jià)達(dá)到了1：51200。本實(shí)驗(yàn)成功地克隆、表達(dá)和純化了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)Hc

5、P基因，并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性進(jìn)行了分析，通過(guò)免疫小鼠獲得了效價(jià)較高的血清。
　　2.siRNA介導(dǎo)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)Hc38基因沉默條件的優(yōu)化
　　將體外孵育的L3期幼蟲(chóng)分別在無(wú)血清和添加5%血清的生理鹽水、PBS、EBSS（Earle’sBalancedSaltSolution）中浸泡培養(yǎng)72h，根據(jù)L3期幼蟲(chóng)的生存狀態(tài)確定最佳浸泡條件，然后分別用2.5%和5%的LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染效果

6、確定轉(zhuǎn)染試劑最佳濃度，最后分別用終濃度30nM、60nM、90nM和120nM的siRNA浸泡24h、48h和72h，RealtimePCR檢測(cè)干擾效果，確定siRNA最佳濃度。L3期幼蟲(chóng)在添加5%血清的EBSS中生存狀態(tài)最好，采用終濃度50μg/ml的LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染可以得到85%的轉(zhuǎn)染效率，而用90nM的siRNA1浸泡72h，干擾效率可以達(dá)到80%以上。本研究對(duì)siRNA介導(dǎo)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)Hc38基因

7、沉默條件進(jìn)行了優(yōu)化，采用優(yōu)化的條件成功抑制了Hc38基因的轉(zhuǎn)錄。
　　3.RNAi介導(dǎo)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)Hc38基因功能驗(yàn)證
　　針對(duì)Hc38基因序列設(shè)計(jì)并合成特異性dsRNA、siRNA，通過(guò)浸泡方式分別將dsRNA、siRNA導(dǎo)入捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)感染性L3期幼蟲(chóng)體內(nèi)，通過(guò)RNA干擾途徑抑制目的基因的轉(zhuǎn)錄，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析Hc38基因在L3期幼蟲(chóng)中的抑制效果，用干擾后的蟲(chóng)體感染綿羊，定期采集羊糞并分離蟲(chóng)卵，研究排卵數(shù)和蟲(chóng)