捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖結(jié)合凝集素的山羊外周血淋巴細胞受體鑒定及功能研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病是由捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）引起的、重要的反芻動物胃腸道寄生線蟲病。該病分布廣泛，危害嚴重。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲也是一種重要的消化道寄生線蟲模式種，對其與宿主間相互作用的研究，有助于揭示消化道線蟲影響宿主免疫反應及引起免疫逃避的具體機制。由寄生性線蟲等蠕蟲排泄分泌的半乳糖結(jié)合凝集素(galectin)能夠顯著調(diào)節(jié)宿主的免疫反應。本實驗室從捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雄蟲和雌蟲體內(nèi)分別克隆得到一種galectin，命

2、名為Hco-gal-m(GenBank No.AY253330)和Hco-gal-f（GenBank No.AY253331）。研究表明，重組Hco-gal-m/f（rHco-gal-m/f）能對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染提供部分的免疫保護力;rHco-gal-m/f能與山羊外周血淋巴細胞結(jié)合，參與調(diào)節(jié)宿主細胞多種細胞因子相關(guān)信號通路，抑制細胞因子的分泌;同時影響細胞的分化和遷移，誘導細胞凋亡。這些結(jié)果提示Hco-gal-m/f直接參與了宿主免疫

3、反應的調(diào)節(jié)，參與蟲體的免疫逃避。然而，Hco-gal-m/f與宿主細胞的哪些受體蛋白結(jié)合，之后活化或調(diào)節(jié)了哪些相關(guān)信號通路從而引起宿主免疫反應的具體分子機制還不清楚。因此，對Hco-gal-m/f在山羊外周血淋巴細胞上膜受體的篩選及研究，有助于闡明Hco-gal-m/f與宿主細胞相互作用和寄生蟲-宿主相互作用的分子基礎及作用機制。
　　1酵母雙雜交系統(tǒng)的構(gòu)建
　　為了研究Hco-gal-m/f與宿主細胞間相互作用的分子機制，

4、在研究中首先構(gòu)建了分裂-泛素酵母雙雜交系統(tǒng)。從山羊外周血淋巴細胞中提取并純化總RNA，合成第一鏈eDNA，再通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增得到雙鏈cDNA，同時在cDNA兩端加上接頭。用限制性內(nèi)切酶SfiⅠ處理cDNA，將其插入文庫質(zhì)粒pPR3-N，電轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒進入大腸桿菌DH10B，建成原始文庫。對原始文庫進行擴增，PCR鑒定重組質(zhì)粒內(nèi)插入片段的大小。之后構(gòu)建了兩個誘餌重組質(zhì)粒pDHB1-gal-m和pDHB1-gal-f，并檢驗

5、了Hco-gal-m/f在酵母中的表達，確定其能夠用于酵母雙雜交篩選。實驗結(jié)果表明，提取的總RNA分子完整，純度高;成功合成雙鏈cDNA。文庫質(zhì)粒中插入片段大小分布在500～2500 bp，平均長度約為1000 bp。原始文庫滴度達到1×106 cfu/mL，擴增后的文庫滴度為1×109 cfu/mL。所構(gòu)建文庫的各項指標均達標，可以用于篩選 Hco-gal-m/f的結(jié)合蛋白。
　　2 Hco-gal-m/f結(jié)合蛋白的篩選及驗證<

6、br>　　使用研究初期構(gòu)建的酵母雙雜交系統(tǒng)進行營養(yǎng)缺陷篩選，共獲得81個陽性克隆。陽性克隆經(jīng)過一輪返板驗證，最終得到能與Hco-Gal-m/f結(jié)合的三個蛋白:TMEM147(transmembrane protein147)、 SERP1(Stress-associated endoplasmic reticulum protein1)和TMEM63A(transmembrane protein63A)。為了進一步驗證Hco-Gal-m

7、/f與候選蛋白的結(jié)合，本研究中使用免疫共沉淀技術(shù)，從兩個方向檢驗了rHco-Gal-m刺激12h后的山羊外周血淋巴細胞中這三個蛋白與Hco-Gal-m的結(jié)合。結(jié)果表明，Hco-Gal-m能夠與PBMC中的TMEM147、SERP1和TMEM63A發(fā)生特異性結(jié)合。此結(jié)果進一步證實了TMEM147、SERP1和TMEM63A是Hco-Gal-m在山羊外周血淋巴細胞上結(jié)合蛋白。這三個結(jié)合蛋白的發(fā)現(xiàn)有助于闡明線蟲galectin與宿主間相互作用

8、的機制。
　　3 Hco-gal-m/f結(jié)合蛋白的定位及功能研究
　　研究中的免疫熒光實驗結(jié)果顯示TMEM147分布于細胞膜上和細胞內(nèi)，SERP1分布于細胞內(nèi)，而TMEM63只分布于細胞膜上。流式細胞檢測結(jié)果表明這三個蛋白在絕大多數(shù)的山羊外周血淋巴細胞上均有表達。細胞經(jīng)RNA干擾后的免疫共沉淀實驗進一步證實TMEM147、SERP1和TMEM63A是Hco-gal-m/f的結(jié)合蛋白及膜受體。細胞經(jīng)RNA干擾后進行的細胞因子轉(zhuǎn)