白色念珠菌誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞中半乳糖凝集素-3的表達(dá)及作用.pdf

1、第一部分、白色念珠菌對(duì)巨噬細(xì)胞U937的活化作用實(shí)驗(yàn)
　　 目的:觀察白色念珠菌對(duì)人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞的活化作用。
　　 方法:觀察不同濃度不同作用時(shí)間點(diǎn)的白色念珠菌刺激人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)液中NO濃度和Galectin-3的表達(dá)以及對(duì)細(xì)胞存活率的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、白色念珠菌終濃度與巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞存活率與因子表達(dá):在107 PFU/mL及以下時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞生長，相對(duì)存

2、活率升高，細(xì)胞中NO及Galectin-3的表達(dá)增強(qiáng)，各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在108 PFU/mL及以上時(shí)，可抑制細(xì)胞生長，相對(duì)存活率降低，細(xì)胞中NO及Galectin-3的表達(dá)降低，各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2、白色念珠菌作用時(shí)間與巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞存活率與因子表達(dá):白色念珠菌處理3h及以上時(shí)，可促進(jìn)細(xì)胞生長，細(xì)胞中NO及Galectin-3的表達(dá)增強(qiáng)，各組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0

3、.05);白色念珠菌處理3h及以下時(shí)，對(duì)細(xì)胞生長影響不大，細(xì)胞中NO及Galectin-3的表達(dá)變化不明顯，組別之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、白色念珠菌濃度在107 PFU/mL及以下時(shí)，刺激人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞活化。對(duì)NO濃度和Galectin-3的表達(dá)以及對(duì)細(xì)胞存活率的影響呈正相關(guān)。
　　 2、白色念珠菌作用時(shí)間3h及以上時(shí)人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞活化。
　　 第

4、二部分、半乳糖凝集素-3在白色念珠菌誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞中的表達(dá)及其功能
　　 目的:觀察Galectin-3在白色念珠菌誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞中的表達(dá)并探討其功能。
　　 方法:通過慢病毒載體介導(dǎo)的Galectin-3-shRNA沉默基因，建立半乳糖凝集素-3基因阻斷的人U937巨噬細(xì)胞株模型，體外評(píng)價(jià)和觀察galectin-3在人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞受白色念珠菌感染時(shí)的細(xì)胞存活率的影響以及細(xì)胞培養(yǎng)

5、液中NO濃度、IL-8、TNF-a、COX2、TLR2和TLR4表達(dá)的變化，Galectin-3與白色念珠菌的結(jié)合測(cè)定，激光共聚焦顯微鏡觀察Galectin-3與TLR2、TLR4的表達(dá)分布。
　　 結(jié)果:
　　 1、利用通用引物對(duì)菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)。獲得陽性克隆4個(gè)，送3號(hào)樣品進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果表明，針對(duì)galectin-3的shRNA序列已經(jīng)成功連入慢病毒載體。
　　 2、定量PCR和Westernblo

6、t檢測(cè)表明細(xì)胞內(nèi)的Galectin-3表達(dá)受到顯著的敲減。
　　 3、白色念珠菌刺激U937后，可促進(jìn)細(xì)胞生長，細(xì)胞中IL-8、TNF-a、COX2、TLR2和TLR4表達(dá)增強(qiáng)，NO水平呈上升，組別之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。沉默Galectin-3后細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞相對(duì)存活率下降，細(xì)胞中IL-8、TNF-a、COX2、TLR2和TLR4表達(dá)增強(qiáng)，NO水平呈上升，組別之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、結(jié)合測(cè)定結(jié)果隨著白色念珠菌濃

7、度的升高，Galectin-3與白色念珠菌的結(jié)合程度相應(yīng)加深，當(dāng)濃度在107 PFU/mL及以上時(shí)有明顯上調(diào)，組別之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)濃度在109 PFU/mL時(shí)，與108 PFU/mL組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。沉默Galectin-3后，得到相似結(jié)果。但是結(jié)合程度較對(duì)照組明顯下降。
　　 結(jié)論:
　　 1、本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了慢病毒載體介導(dǎo)的Galectin-3-shRNA沉默基因人U937巨噬細(xì)胞株模型。
　　 2、

8、Galectin-3對(duì)白色念珠菌刺激人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)液中NO濃度、IL-8、TNF-α、COX2、TLR2和TLR4表達(dá)的調(diào)節(jié)呈負(fù)相關(guān)，對(duì)細(xì)胞存活率的影響呈正相關(guān)。
　　 3、Galectin-3能與白色念珠菌直接結(jié)合。
　　 第三部分、半乳糖凝集素-3在白色念珠菌誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞中的作用機(jī)制分析
　　 目的:探討半乳糖凝集素-3在白色念珠菌誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞中的作用機(jī)

9、制。
　　 方法:蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞中FAS、NF-κB、JNK和ERK1/2蛋白含量。
　　 結(jié)果:
　　 1、在Galectin-3被抑制的情況下，白念珠菌感染會(huì)造成細(xì)胞中FAS和NF-κB蛋白的表達(dá)上調(diào)。
　　 2、在Galectin-3被抑制的情況下，白念珠菌感染會(huì)造成細(xì)胞中磷酸化JNK表達(dá)上調(diào)和磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 1