Rno-let-7d調(diào)節(jié)半乳糖凝集素3表達(dá)在ADHD大鼠腦中的作用.pdf

1、目的：比較ADHD大鼠模型SHR大鼠與WKY大鼠行為學(xué)差異,驗(yàn)證SHR.大鼠作為ADHD動(dòng)物模型的可靠性；比較SHR大鼠與WKY大鼠主要腦區(qū)、主動(dòng)脈、肝臟中半乳糖凝集素3的表達(dá)差異；篩查并證明半乳糖凝集素3和酪氨酸羥化酶相關(guān)microRNAs；明確半乳糖凝集素3是否能夠影響TH的表達(dá)。
　　 方法：開場實(shí)驗(yàn)比較SHR大鼠與WKY大鼠自發(fā)活動(dòng)差異；l(a)t迷宮比較SHR大鼠與WKY大鼠非選擇性注意差異；western blot、

2、PCR、免疫組化檢測主要腦區(qū)半乳糖凝集素3蛋白及mRNA表達(dá)水平；利用芯片技術(shù)篩查SHR、WKY大鼠腦前額區(qū)microRNAs差異,通過數(shù)據(jù)庫比較,確定可能相關(guān)的microRNAs;維甲酸(RetinoicAcid,RA)處理低分化PC12細(xì)胞后,PCR檢測microRNAs表達(dá)；構(gòu)建microRNAs表達(dá)載體、熒光素酶報(bào)告載體；共轉(zhuǎn)染microRNAs表達(dá)載體、熒光素酶報(bào)告載體檢測熒光素酶活性；轉(zhuǎn)染microRNAs表達(dá)載體,檢測79

3、19細(xì)胞和(或)PC12細(xì)胞半乳糖凝集素3及酪氨酸羥化酶表達(dá);PCR、western blot、免疫組化、免疫熒光檢測高、低分化PC12細(xì)胞半乳糖凝集素3及TH表達(dá);RA處理低分化PC12細(xì)胞后,PCR、western blot檢測半乳糖凝集素3及TH表達(dá)；神經(jīng)生長因子(NerveGrowth Factor,NGF)處理高分化PC12細(xì)胞后,PCR、western blot檢測半乳糖凝集素3及TH表達(dá)；構(gòu)建半乳糖凝集素3表達(dá)質(zhì)粒及干擾質(zhì)

4、粒,分別轉(zhuǎn)染高、低分化PC12細(xì)胞后,檢測半乳糖凝集素3及TH表達(dá)。
　　 結(jié)果：開場實(shí)驗(yàn)中SHR大鼠穿越格子數(shù)、直立次數(shù)明顯多于WKY大鼠；l(a)t迷宮中SHR大鼠穿越角落、直立次數(shù)明顯多于WKY大鼠；與WKY大鼠相比,SHR大鼠前額區(qū)、紋狀體、中腦半乳糖凝集素3蛋白表達(dá)分別下降38％、57％、45％左右,而在小腦、主動(dòng)脈、肝臟沒有明顯下降；在SHR大鼠前額區(qū),mo-let-7d是唯一升高的microRNA；RA處理低分化P

5、C12細(xì)胞后,mo-let-7d表達(dá)升高；7919細(xì)胞和PC12細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)染mo-let-7d表達(dá)載體、熒光素酶報(bào)告載體(包含Lgals3-3’UTR),顯示luciferase活性降低,點(diǎn)突變Lgals3-3’UTR結(jié)合位點(diǎn)(C→G)結(jié)果發(fā)現(xiàn),突變后mo-let-7d過度表達(dá)對(duì)luciferase活性的抑制消失；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染mo-let-7d表達(dá)載體,結(jié)果顯示mo-let-7d過度表達(dá)使低分化PC12細(xì)胞和7919細(xì)胞半乳糖凝集素3蛋白

6、水平分別降低約34％和40％,但mRNA水平?jīng)]有明顯改變,并使低分化PC12細(xì)胞酪氨酸羥化酶表達(dá)下降約38％；共轉(zhuǎn)染mo-let-7d表達(dá)載體、熒光素酶報(bào)告載體(包含TH-3,UTR)結(jié)果顯示mo-let-7d過表達(dá)并沒有使luciferase活性降低:高分化PC12細(xì)胞相對(duì)低表達(dá)半乳糖凝集素3和TH,低分化PC12細(xì)胞相對(duì)高表達(dá)半乳糖凝集素3和TH；RA同時(shí)下調(diào)低分化PC12細(xì)胞半乳糖凝集素3和酪氨酸羥化酶表達(dá)；NGF同時(shí)上調(diào)高分化P