TMEM63A在捻轉血矛線蟲半乳糖結合凝集素調節(jié)山羊外周血單個核細胞功能中的作用.pdf

1、捻轉血矛線蟲是牛羊等反芻動物重要的腸道寄生性線蟲。它寄生在牛羊等宿主動物真胃及小腸內，靠吸食宿主血液為生。感染捻轉血矛線蟲能夠引起宿主免疫功能低下，造成宿主貧血、消瘦及死亡，死亡多發(fā)生于羔羊。給世界范圍內畜牧業(yè)造成重大經濟損失。
　　Hco-gal-m(Acc.No.AY253330)和Hco-gal-f(Acc.No.AY253331)是由本實驗室首次發(fā)現，分離，體外克隆表達的，分別來自于捻轉血矛線蟲雌蟲和雄蟲的半乳糖結合凝集素

2、。本實驗室目前研究表明，重組Hco-gal-m/f(rHco-gal-m/f)能夠以劑量依賴方式誘導細胞凋亡，降低細胞遷移能力，減少氧自由基釋放，降低NO產量和細胞因子水平。當用rHco-gal-m/f免疫山羊時，會出現糞便內蟲卵量降低，山羊體內蟲體減少，IgG水平上升等變化。而跨膜蛋白63A(TMEM63A)是Ⅳ型跨膜蛋白。進一步研究證明，TMEM63A在大多數山羊外周血單個核細胞上表達，參與細胞因子調節(jié)。然而，目前TMEM63A只在

3、為數不多的幾種哺乳動物上發(fā)現，其功能均未知。本實驗室通過大量實驗證實了TMEM63A是捻轉血矛線蟲半乳糖結合凝集素在山羊外周血單個核細胞上的受體或結合蛋白。本文使用抗體封閉技術、RNA干擾技術研究TMEM63A對Hco-gal-m/f調節(jié)PBMCs（單核細胞）增殖、遷移、吞噬以及NO分泌功能的影響。
　　1.TMEM63A-Ⅰ原核克隆表達
　　由于TMEM63A是一個多次跨膜蛋白，且疏水性較強，不能以整體的形式在原核表達系統(tǒng)

4、中表達。我們選擇TMEM63A最長膜內區(qū)片段TMEM63A-Ⅰ作為目的片段進行克隆表達。TMEM63A-Ⅰ全長648bp。對其進行生物學信息分析，發(fā)現此片段疏水性較弱，有B細胞作用位點。首先將TMEM63A-Ⅰ重組進入pMD18-T載體，用以TMEM63A-Ⅰ基因片段保存。經測序分析，發(fā)現載體中TMEM63A-Ⅰ基因片段與NCBI中該片段同源性達100％。隨后，構建表達載體pET-28a-TMEM63A-Ⅰ，并將其轉化入宿主菌BL21，

5、構建表達菌株BL21-pET-28a-TMEM63A-Ⅰ。用IPTG誘導5h，收集菌液。SDS-PAGE分析顯示，表達蛋白25KD大小，存在于包涵體中。用鎳柱純化蛋白。
　　2.多克隆抗體制備
　　用腸激酶切去純化后蛋白上的載體標簽，收集無標簽純化蛋白，測濃度后分裝保存。用無標簽純化蛋白與弗氏佐劑混成乳濁液，多次免疫大鼠。收集免疫大鼠血清，用飽和硫酸銨純化法純化多克隆抗體anti-63-IP。用免疫共沉淀方法驗證多克隆抗體a

6、nti-63-IP的特異性。Western blot結果顯示，anti-63-IP能夠特異性識別天然構象TMEM63A。用間接ELISA方法檢測多克隆抗體效價。
　　3.TMEM63A在Hco-gal-m/f調節(jié)PBMCs功能中的影響
　　抗體封閉技術實驗結果顯示，單獨用40μg/mLHco-gal-m/f與PBMCs（或單核細胞）共孵育，同單獨細胞對照組相比，PBMCs（或單核細胞）的增殖能力、NO分泌能力、遷移能力被抑制

7、。說明Hco-gal-m/f可以抑制PBMCs（或單核細胞）的增殖能力、NO分泌能力和遷移能力。用濃度為2ug/mL的TMEM63A特異性抗體anti-63A IgG和40μg/mLHco-gal-m/f與PBMCs（或單核細胞）共孵育，同用40μg/mLHco-gal-m/f共孵育組相比，PBMCs（或單核細胞）的增殖能力、NO分泌能力、遷移能力明顯提高，但與單獨細胞對照組相比，PBMCs（或單核細胞）的增殖能力、NO分泌能力、遷移能

8、力變化不明顯。用濃度為2ug/mL的非特性性抗體Neg A IgG和40μg/mLHco-gal-m/f與細胞共孵育，同40μg/mLHco-gal-m/f共孵育組相比，細胞增殖能力、吞噬能力、NO分泌能力、遷移能力無顯著改變。說明特異性抗體anti-63A IgG可以阻斷Hco-gal-m/f與受體TMEM63A的結合，進而阻斷Hco-gal-m/f對細胞功能的影響。RNA干擾技術研究結果顯示，用特異性TMEM63A干擾RNATMEM