重組捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖結(jié)合凝集素免疫山羊真胃細胞因子表達定位.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖結(jié)合凝集素(Galectin)和半胱氨酸蛋白酶(CysteineProtease)在宿主與寄生蟲相互作用過程中起到了重要的作用。 基于本實驗室以前的研究,本論文主要進行了以下的工作： 1.地高辛標記探針的制備 根據(jù)GenBank發(fā)表的山羊IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-1B和TNF-α序列設(shè)計引物,以本試驗室保存的相關(guān)細胞因子為模板,經(jīng)PCR法合成地高辛標記的探針。瓊脂糖凝膠電泳

2、檢測探針分子量大小與設(shè)計值相符。紫外分光光度法檢測上述探針的濃度分別為0.82μg/μL、0.56μg/μL、0.72μg/μL、0.69μg/μL、0.91μg/μL和0.78μg/μL。斑點雜交顯示探針的標記效率高達0.001ng。RT-PCR和山羊外周血淋巴細胞原位雜交法證明地高辛標記的探針具有特異性。 2.重組捻轉(zhuǎn)血矛線蟲galectins免疫山羊真胃細胞因子表達定位 用重組雌、雄捻轉(zhuǎn)血矛線蟲galectins(

3、rHco-GAL-m/f)免疫山羊,通過原位雜交法對陰性對照組(A)、攻蟲對照組(B)、免疫攻蟲組(C)和免疫非攻蟲組(D)山羊真胃中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ和TNF-α進行了定位,并對真胃中上述細胞因子的陽性反應(yīng)細胞數(shù)量做了分析。結(jié)果顯示：細胞因子mRNA僅在真胃的黏膜下層中轉(zhuǎn)錄,表現(xiàn)為有藍色的反應(yīng)信號。其中A組山羊真胃組織中無反應(yīng)信號,其他3 組真胃黏膜下層中均有上述細胞因子mRNAS的藍色反應(yīng)信號。IL

4、-4和IL-6陽性反應(yīng)細胞數(shù)量在B、C和D組山羊真胃黏膜下層中差異顯著(P<0.05),與B組和D組的陽性反應(yīng)細胞數(shù)相比,C組要明顯高于其它兩組。IL-1B、IL-2和TNF-α陽性反應(yīng)細胞數(shù)量在B、C和D組山羊真胃黏膜下層中差異顯著(P<0.05),與B組和C組的陽性反應(yīng)細胞數(shù)相比,D組要明顯高于其它兩組。另外,IFN-γ陽性反應(yīng)細胞數(shù)量在B組和C組之間的差異不顯著(P>0.05),D組與B組和C組之間差異顯著(P<0.05),且明顯

5、高于其它兩組.以上結(jié)果說明rHco-GAL-m/f能夠有效誘導(dǎo)山羊真胃局部免疫應(yīng)答。 3.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲galectins階段性表達的檢測 提取捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第1期幼蟲,第2期幼蟲、第3期幼蟲和雌、雄成蟲的天然蛋白,并用Bradfbrd法測蛋白質(zhì)濃度。分別用兔抗重組捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌、雄成蟲galectins血清為一抗,通過Western blot法檢測galectin在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲上述生活階段的表達并定量分析。結(jié)果顯示,gal

6、ectin只在雌、雄成蟲階段表達,表現(xiàn)為一條約33kDa的條帶,兩種一抗均能識別雌、雄成蟲galectins。圖像分析表明,galectin在雌蟲中的雜交條帶灰度是雄蟲的1.4倍。 4.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半胱氨酸蛋白酶(Hc58)階段性表達的檢測 應(yīng)用在第三章中制備的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第1期幼蟲、第2期幼蟲、第3期幼蟲和雌、雄成蟲天然蛋白,用山羊抗重組捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc58血清為一抗,通過Western blot檢測Hc58在捻轉(zhuǎn)血矛