捻轉(zhuǎn)血矛線蟲胰島素樣信號傳導通路重要基因結(jié)構與功能的研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchuscontortus）是寄生于反芻動物皺胃的寄生線蟲，呈全球性分布，感染嚴重可導致幼畜的死亡，造成巨大的經(jīng)濟損失。由于缺乏有效的疫苗，針對寄生線蟲病的控制主要依賴于抗蠕蟲藥，但是長期過度的使用抗蠕蟲藥已經(jīng)造成抗藥性的產(chǎn)生以及動物產(chǎn)品及環(huán)境藥物殘留問題。新藥物和有效疫苗的研發(fā)因此越來越受到關注，而這必須對線蟲的分子生物學有深入的了解。通過選擇寄生線蟲生活史中的關鍵過渡階段作為研究對象，不僅能夠幫助了解其生長

2、發(fā)育的分子調(diào)控機制，而且也為防控寄生線蟲病提供理論依據(jù)。
　　一些重要的寄生線蟲（包括豬蛔蟲、馬來絲蟲、犬惡絲蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、羅拉絲蟲和美洲板口線蟲）在基因組和轉(zhuǎn)錄組取得的進展為分子生物學的研究提供了很好的平臺。然而，體外培養(yǎng)和有效的基因操作技術缺乏嚴重阻礙了基因功能的研究。和秀麗新桿線蟲(C.elegans)存在類似的滯育階段(dauer)，兩者在生物學上存在諸多的相似性。首先秀麗新桿線蟲同屬于第五家族與H.contortus

3、親緣關系近，對外界環(huán)境有很強抵抗性，dauer可存活幾個月并可以恢復發(fā)育完成生活史，與之相似，毛圓線蟲(Strongylid)也存在類似的發(fā)育階段(iL3)，對外界環(huán)境有很強抵抗力，不攝取食物可存活數(shù)月。基于生物學上的相似性，一些學者提出了“dauerhypothesis”和“Daf-c”假說，認為寄生線蟲三期幼蟲階段和C.elegans的dauer由相似的分子調(diào)控機制共同調(diào)節(jié)。C.elegans作為模式生物，對其發(fā)育生物學和分子生物學

4、的研究處于前沿。研究發(fā)現(xiàn)dauer機制主要由胰島素樣信號通路調(diào)控，包括胰島素樣受體DAF-2，磷脂酰肌醇3-激酶AGE-1和AAP-1，3-磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶PDK-1和叉頭轉(zhuǎn)錄因子DAF-16等。對daf-2，age-1和pdk-1突變會導致daf-c表型的出現(xiàn)，突變daf-16則是daf-d表型。信號通過DAF-2以磷酸化的方式激活AKT-1/2，再負反饋調(diào)節(jié)DAF-16，在調(diào)節(jié)生命周期、生長發(fā)育和抗逆性中發(fā)揮重要的功能作用。

5、盡管對秀麗新桿線蟲的dauer調(diào)控機制有較深入地了解，但對大多數(shù)寄生線蟲而言，其發(fā)育調(diào)節(jié)幾乎是一無所知。
　　因此，本研究通過功能基因組學的方法分離了可能對H.contortus的發(fā)育發(fā)揮作用的Hc-daf-2、Hc-age-1、Hc-aap-1和Hc-pdk-1四個基因;RNAseq方法分析了基因在H.contortus的各個發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平變化;異源轉(zhuǎn)基因方法分析了基因啟動子在秀麗新桿線蟲的表達模式，基因救援法分析了基因的功

6、能特點，從而在分子水平上對H.contortus的滯育發(fā)育(iL3)有更加深入的認識。
　　(1)胰島素樣受體(Hc-DAF-2)結(jié)構與功能的研究
　　采用兼并引物的方法分離Hc-daf-2基因的EST序列，在此基礎上通過RACE，GenomeWalker和Long-rangePCR獲得全長cDNA，gDNA和上游啟動子序列。Hc-DAF-2與DAF-2家族基因高度同源，存在保守的結(jié)構功能域，并且存在與人胰島素受體一致的蛋白

7、水解位點（RKRR），推測與形成胰島素受體復合物相關。Hc-daf-2在各個發(fā)育階段都可轉(zhuǎn)錄，在感染性的L3期表達豐度明顯上調(diào)。Hc-daf-2和Ce-daf-2啟動子的表達模式，在C.elegans頭感器神經(jīng)位置表達具有相似性。另外，通過基因救援法發(fā)現(xiàn)Hc-daf-2基因?qū).elegansdaf-2缺失株(CB1370)能夠呈現(xiàn)部分救援的效果。
　　(2)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)結(jié)構與功能的研究
　　編碼PI3K

8、兩個亞單位的基因Hc-age-1和Hc-aap-1與AGE-1和AAP-1家族具有很高的同源性，并且具有保守的結(jié)構功能區(qū)。轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn)Hc-age-1和Hc-aap-1基因在各個發(fā)育期都表達，在蟲卵期、感染性L3期和雌性成蟲期表達上調(diào)。啟動子的表達模式研究，發(fā)現(xiàn)Hc-age-1和Hc-aap-1啟動子驅(qū)動GFP在C.elegans腸道表達豐富，而Ce-age-1和Ce-aap-1在神經(jīng)和腸道均有表達，更側(cè)重于神經(jīng)。在哺乳動物、果蠅和

9、C.elegans中，AGE-1和AAP-1會結(jié)合成二聚體構成PI3K激酶，為了研究Hc-age-1和Hc-aap-1是否會發(fā)生聚合，通過酵母雙雜交的方法發(fā)現(xiàn)兩者在酵母系統(tǒng)中能夠高親和力結(jié)合?；蚓仍ǚ治霭l(fā)現(xiàn)Hc-age-1基因?qū).elegansage-1缺失株CY246沒有呈現(xiàn)救援作用。
　　(3)3-磷脂酰肌醇依賴性蛋白激酶(Hc-PDK-1)結(jié)構與功能的研究
　　Hc-pdk-1與Ce-pdk-1基因有很高的同源性

10、(46％)，存在保守的功能區(qū)激酶催化區(qū)和PH區(qū)。PH區(qū)是一大類蛋白的功能調(diào)節(jié)區(qū)，在細胞信號轉(zhuǎn)導以及細胞骨架功能中有重要作用。轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn)Hc-pdk-1在各個發(fā)育階段均表達。轉(zhuǎn)基因分析Hc-pdk-1和e-pdk-1基因啟動子表達模式，Hc-pdk-1啟動子表達在C.elegans的腸道組織，Ce-pdk-1主要表達在頭部神經(jīng)，咽部和腸道，兩者在腸道部位存在一定的相似性。
　　總之，這些發(fā)現(xiàn)有助于在分子水平上了解H.conto