捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖凝集素調(diào)節(jié)山羊PBMC免疫功能的蛋白組學(xué)研究及信號通路分析.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）屬毛圓科（Trichostrongylidae）血矛屬（Haemonchus）線蟲，主要寄生于宿主皺胃（偶見于小腸），以吸食宿主的血液為生。由于蟲體刺破胃粘膜吮血，可引起宿主皺胃黏膜的損傷，從而影響宿主的代謝，降低飼料利用率，并最終導(dǎo)致患畜貧血、腹瀉和慢性消耗性衰竭，嚴(yán)重的甚至可以導(dǎo)致患畜死亡，對畜牧業(yè)造成極大經(jīng)濟損失。
　　半乳糖凝集素(galectins)是一種廣泛分布于

2、脊椎動物和無脊椎動物中的S型凝集素。它們功能多樣，參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌和免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)過程，并可作為模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）在宿主免疫細(xì)胞與病原的相互作用中發(fā)揮作用。
　　此前，分別從捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的雄蟲和雌蟲中克隆鑒定了Hco-gal-m(Acc.No.AY253330)和Hco-gal-f(Acc.No.AY253331)兩種galect

3、ins。生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)，Hco-gal-m/f能夠誘導(dǎo)山羊淋巴細(xì)胞的凋亡，抑制淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。同時，Hco-gal-m/f具有免疫保護性，用重組蛋白(rHco-gal-m/f)免疫過的山羊在人工感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲后，排蟲卵量和荷蟲數(shù)顯著降低，血清中IgG的含量大幅提高。
　　所有這些證據(jù)表明，Hco-gal-m/f對宿主的免疫反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)能力。但是，其作用的分子機制目前還知之甚少。因此，在先前的工作基礎(chǔ)上進行了以

4、下研究:
　　1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖凝集素的發(fā)育表達與組織分布
　　為了研究捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖凝集素(Hco-gal-m/f)在不同發(fā)育時期的蟲體中的表達水平，我們根據(jù)已報道的基因序列設(shè)計合成了特異性引物，以卵、三期幼蟲、脫殼三期幼蟲、四期幼蟲以及成蟲的cDNA為模板進行real-time PCR檢測，發(fā)現(xiàn)Hco-gal-m/f基因在卵和三期幼蟲中幾乎無表達，在四期幼蟲時出現(xiàn)表達，在成蟲中表達量最高，且在雌蟲的表達水平高于雄

5、蟲。同時，用重組捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖凝集素蛋白(rHco-gal-m/f)免疫大鼠制備的抗血清進行Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的不同發(fā)育時期Hco-gal-m/f在蛋白質(zhì)水平的變化趨勢與核酸水平的變化基本一致。此外，利用冰凍切片結(jié)合免疫熒光技術(shù)對Hco-gal-m/f在蟲體中的分布進行組織定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hco-gal-m/f主要分布在成蟲小腸內(nèi)壁微絨毛上，鮮見于其它部位。
　　2.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖凝集素作用下

6、山羊PBMC差異表達蛋白的研究及相關(guān)信號通路分析
　　捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖凝集素(Hco-gal-m/f)具有重要的免疫調(diào)節(jié)功能。為了研究Hco-gal-m/f調(diào)節(jié)山羊外周血單個核細(xì)胞(PBMC)免疫功能的分子機制，本文應(yīng)用雙向電泳和實時定量PCR的方法，對重組Hco-gal-m/f(rHco-gal-m/f)刺激前后的山羊PBMC進行差異蛋白篩選和相關(guān)信號通路分析。比較蛋白組的結(jié)果顯示，rHco-gal-m/f刺激前后共有16個蛋

7、白的表達發(fā)生顯著變化。這些差異表達蛋白主要參與應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞運動;15個蛋白(93.8％)具有結(jié)合活性，9個蛋白(56.3％)具有催化活性。對相關(guān)信號通路關(guān)鍵基因進行的定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，rHco-gal-m/f能夠激活TLR通路和CASPASE通路，對于VEGF、NFκB和自由基產(chǎn)生等信號通路則表現(xiàn)出抑制作用。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合基因表達分析為探尋Hco-gal-m/f的作用靶位點和研究Hco-gal-m/f的免疫調(diào)節(jié)機理提供了新的線索。<

8、br>　　3.有絲分裂原活化山羊PBMC的蛋白組學(xué)研究及捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖凝集素的抑制作用分析
　　外周血單個核細(xì)胞(PBMC)在固有免疫和獲得性免疫中具有重要作用，而捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖凝集素(Hco-gal-m/f)則是一類重要的免疫抑制分子。為了探索山羊PBMC的活化標(biāo)志和分子機制，以及Hco-gal-m/對細(xì)胞因子分泌的抑制作用，本文應(yīng)用雙向電泳和實時定量PCR對ConA活化前后及rHco-gal-m/f刺激下的山羊PBMC

9、進行差異蛋白分析和相關(guān)信號通路檢測。比較蛋白組的結(jié)果顯示，ConA刺激前后共有22個蛋白的表達發(fā)生顯著變化，這些差異表達蛋白主要參與基質(zhì)重建、肌絲聚合、轉(zhuǎn)錄起始、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控等。定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，ConA能夠促進細(xì)胞因子及其受體、ERK1/2、P38、STAT和CDK等信號通路的活化，對SOCS和PIAS通路則表現(xiàn)出抑制作用。rHco-gal-m/f刺激后ConA活化的PBMC中共有5個蛋白發(fā)生顯著變化，其中CAP

10、G和LAP3的表達發(fā)生明顯的反轉(zhuǎn)，上述多條信號通路的活化受到干擾，除IL-10外的多種細(xì)胞因子、ERK1/2、P38和CDK通路的活化受到抑制，而SOCS1，3則轉(zhuǎn)錄增強。活化標(biāo)志分子的鑒定和相關(guān)通路分析，不僅為研究病原感染過程中山羊PBMC的炎性活化提供新的線索，同時為研究Hco-gal-m/f的免疫抑制效應(yīng)提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　4.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖凝集素對山羊外周血T細(xì)胞和單核細(xì)胞的不同調(diào)節(jié)作用
　　單核細(xì)胞和T

11、細(xì)胞是外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)的兩個主要亞群，在固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用。不同的半乳糖凝集素(galectins)分子對不同類型的細(xì)胞具有多種不同的調(diào)節(jié)效應(yīng)。在本試驗中，我們利用捻轉(zhuǎn)血矛線蟲半乳糖凝集素(Hco-gal-m)的重組蛋白(rHco-gal-m)對其在山羊外周血單核細(xì)胞與T細(xì)胞中的調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)作用進行了研究和分析。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)rHco-

12、gal-m能夠緊密地結(jié)合在單核細(xì)胞與T細(xì)胞表面。ELISA測試表明，rHco-gal-m能夠抑制IL-6、IL-10和TNF-α等細(xì)胞因子在T細(xì)胞中的表達;但是在單核細(xì)胞中，rHco-gal-m卻能誘導(dǎo)大量的IL-10產(chǎn)生。實時定量PCR分析證明，單核細(xì)胞和T細(xì)胞的活化同樣能受到rHco-gal-m的抑制，兩種細(xì)胞表面的活化標(biāo)志分子MHC-Ⅱ和CD25的表達水平顯著降低。與此相應(yīng)，T細(xì)胞的增殖亦被rHco-gal-m阻斷。不僅如此，進一