捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因真核載體構(gòu)建及綿羊免疫保護(hù)性試驗(yàn).pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是毛圓科血矛屬消化道線蟲，感染牛、綿羊、山羊及其他反芻動(dòng)物，引起動(dòng)物貧血及貧血綜合癥，嚴(yán)重的可致動(dòng)物大批死亡，特別是羔羊，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，主要采用化學(xué)藥物治療該病，但藥物殘留嚴(yán)重，加之抗藥性蟲株的出現(xiàn)和蔓延，使得化學(xué)治療方法受到了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。應(yīng)用免疫學(xué)方法防治該病十分迫切和必要。Hc38基因在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲腸上皮微絨毛內(nèi)高豐度表達(dá)，據(jù)推測(cè)它的表達(dá)產(chǎn)物是一種重要的功能蛋白，與其吸血和免疫逃避機(jī)制有關(guān)。該基因表達(dá)

2、產(chǎn)物的196-512位氨基酸構(gòu)成的保守結(jié)構(gòu)域?qū)儆诠δ芪粗牡鞍准易錺f04910，該家族目前有71條蛋白序列登錄在GeneBank上，它們分屬于45種生物，其中的14種為人類或動(dòng)物的重大血源性疫病病原或傳播媒介。GenBank中注冊(cè)了該抗原基因的全序列，然而他的功能國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)資料報(bào)道。本研究主要內(nèi)容如下： ⑴根據(jù)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因產(chǎn)物（登錄號(hào)：AY749124）保守結(jié)構(gòu)域所在核酸序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，該引物包含Kozak序

3、列、HindⅢ酶切位點(diǎn)、XbaⅠ酶切位點(diǎn)。以含有捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因保守結(jié)構(gòu)域片段的pMD19-T為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得Hc38基因保守結(jié)構(gòu)域片段，酶切、連接后獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1-Hc38。經(jīng)酶切分析、序列測(cè)定和PCR鑒定，證實(shí)了插入片段的正確性。 ⑵以實(shí)驗(yàn)中得到的含Hc38基因保守結(jié)構(gòu)域片段的菌種大量培養(yǎng)，堿裂解法分批大量提取質(zhì)粒。用PEG法純化質(zhì)粒，取適量測(cè)定OD260/OD280值在1.8-2.0之間，結(jié)果

4、所獲質(zhì)粒符合轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求，并根據(jù)OD260定量。本實(shí)驗(yàn)佐劑采用分枝型PEI衍生物和特定成分的GenEscortTM及人工制備的脂質(zhì)體，將質(zhì)粒DNA用脂質(zhì)體包裹后，油鏡下觀察，該佐劑不改變分子結(jié)構(gòu)，可以降低DNA的抗原性，減少質(zhì)粒的用量，具有緩釋和控釋作用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)染佐劑進(jìn)行初步探索，以期望達(dá)到理想的試驗(yàn)效果。 ⑶采用蟲體取卵和孵化后感染驅(qū)蟲后的綿羊，然后大量收集感染羊糞便，集中孵化，就可得到大量單一捻轉(zhuǎn)血矛線蟲三期幼

5、蟲。 ⑷將Hc38保守結(jié)構(gòu)域部分所在真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Hc38分別采用不同免疫程序、不同免疫途徑和不同劑量免疫綿羊。用10000條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第三期幼蟲攻擊后，對(duì)不同組綿羊排出蟲卵數(shù)、蟲卵孵化率和成蟲數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，免疫組綿羊排出蟲卵減少66％、成蟲減少33％。特別值得注意的是免疫組的靜脈注射方式產(chǎn)生抗體最高，相應(yīng)羊的蟲卵數(shù)和成蟲數(shù)低。 ⑸捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因保守結(jié)構(gòu)域部分及最大ORF部分片段所

6、在原核表達(dá)載體pPROEXHTa-Hc38、pET28a-Hc38-orf分別轉(zhuǎn)化入宿主菌DH5a、BL21，IPTG誘導(dǎo)后，大量收集菌體，經(jīng)過(guò)破碎、洗滌、溶解、復(fù)性、純化后，然后分別免疫綿羊。用10000條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第三期幼蟲攻擊后，對(duì)不同組綿羊排出蟲卵數(shù)、蟲卵孵化率和成蟲數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)保守結(jié)構(gòu)域抗原和原核表達(dá)ORF抗原均誘導(dǎo)產(chǎn)生了相應(yīng)抗體。將DNA疫苗、兩種蛋白疫苗分別與對(duì)照組比較，免疫組綿羊排出蟲卵減少依次為8