中國(guó)地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲苯并咪唑類抗藥性相關(guān)基因Ⅰ型β微管蛋白編碼基因多樣性的研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)是危害反芻動(dòng)物最主要的病原之一，呈全球性分布，在熱帶和亞熱帶地區(qū)感染尤為嚴(yán)重，成蟲主要寄生在反芻動(dòng)物的皺胃及小腸，以吸取宿主血液為生，臨床表現(xiàn)為貧血、水腫和腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可引起宿主死亡。由于缺乏相應(yīng)的商業(yè)化疫苗，應(yīng)用化學(xué)驅(qū)蟲藥仍是治療捻轉(zhuǎn)血矛線蟲感染的首要措施，但是長(zhǎng)期無節(jié)制的使用藥物，導(dǎo)致在全球范圍內(nèi)都出現(xiàn)了抗藥性的問題，甚至有的地區(qū)已發(fā)展為多重抗藥性。為了更好的制定有效的應(yīng)

2、對(duì)措施，延緩抗藥性的產(chǎn)生，了解抗藥性相關(guān)突變的起源與分布勢(shì)在必行。
　　苯并咪唑類藥物是最常用的三類驅(qū)蟲藥之一，也是目前抗藥性機(jī)制研究最為透徹的。已經(jīng)證明，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的Ⅰ型β微管蛋白基因的三個(gè)SNP位點(diǎn)(F167Y，E198A和F200Y)是引起苯并咪唑類產(chǎn)生抗藥性的主要原因。國(guó)外已有大量關(guān)于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲苯并咪唑類抗藥性的報(bào)道，近些年還出現(xiàn)了抗藥性突變起源和分布方面的研究，但是國(guó)內(nèi)在此方面的研究相對(duì)匱乏，因此本研究通過對(duì)中國(guó)地區(qū)

3、不同種群的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲進(jìn)行Ⅰ型β微管蛋白基因的分析，從而預(yù)測(cè)了抗藥性的存在、抗藥程度和分布情況，以及進(jìn)行了種群遺傳多樣性分析和抗藥性突變起源的分析。
　　(1)Ⅰ型β微管蛋白基因的多樣性分析
　　選取了湖北、河北、云南、陜西、廣西、內(nèi)蒙古、遼寧和黑龍江八個(gè)種群，共192條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雄蟲用于Ⅰ型β微管蛋白基因的擴(kuò)增，并采用直接測(cè)序的方法進(jìn)行三個(gè)SNP位點(diǎn)的檢測(cè)。在中國(guó)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲種群中，都沒有檢測(cè)到167位點(diǎn)的突變(F16

4、7Y)，而198和200位點(diǎn)都出現(xiàn)了不同程度的突變(E198A和F200Y);根據(jù)198和200位點(diǎn)的突變情況，一共檢測(cè)到了六種基因型;除此之外，計(jì)算了兩個(gè)基因座的等位基因頻率，在198位點(diǎn)，抗藥型等位基因頻率為0-70％;在200位點(diǎn)，抗藥型等位基因頻率為0-31％。
　　通過構(gòu)建基因池對(duì)八個(gè)種群進(jìn)行了遺傳多樣性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，八個(gè)種群的單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性都較為豐富，單倍型多樣性(Hd)變化從0.455到0

5、.939，核苷酸多樣性指數(shù)(π)的變化從0.018到0.039;種群間配對(duì)的FST值都相對(duì)較低，從0.00907到0.30732，表明八個(gè)種群的遺傳分化程度不高，種群之間存在較高的基因流動(dòng)，中國(guó)地區(qū)的種群中沒有較明顯的遺傳結(jié)構(gòu);AMOVA顯示有93％的遺傳變異來自種群內(nèi)部，不同地理位置和不同宿主對(duì)中國(guó)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的種群結(jié)構(gòu)影響較小。
　　運(yùn)用三種方法進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示兩個(gè)E198A的單倍型序列分布在進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖的兩個(gè)不同

6、的分支部分，同時(shí)每個(gè)分支還含有至少一個(gè)敏感型的單倍型序列，表明中國(guó)地區(qū)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲中E198A具有兩個(gè)獨(dú)立的起源;7個(gè)含有F200Y的單倍型序列分布在進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖的三個(gè)不同的分支部分，每個(gè)分支也含有至少一個(gè)敏感型單倍型序列，表明F200Y具有至少三個(gè)不同的起源。
　　(2)四引物ARMS-PCR檢測(cè)方法的建立
　　基于本研究的結(jié)果，設(shè)計(jì)了四引物ARMS-PCR方法用于Ⅰ型β微管蛋白基因E198A的檢測(cè)，并與直接測(cè)序結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)

7、確度的比較。結(jié)果顯示優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，尤其是調(diào)整內(nèi)外引物的濃度比例可以達(dá)到更好的擴(kuò)增效果。通過瓊脂糖凝膠電泳可以清晰的區(qū)分該位點(diǎn)三種不同的基因型，同時(shí)出現(xiàn)433bp和200bp表示純合敏感基因型，同時(shí)出現(xiàn)433bp和284bp表示純合抗藥基因型，同時(shí)出現(xiàn)433bp，284bp和200bp表示雜合基因型。表明該方法可以成功用于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲E198A的檢測(cè)，并且準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)單。
　　本研究首次對(duì)中國(guó)地區(qū)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的苯并咪唑類抗