柑橘木虱對殺蟲劑敏感性檢測及抗藥性相關基因分析.pdf

1、柑橘木虱是柑橘毀滅性病害柑橘黃龍病的傳播媒介。化學控制柑橘木虱是遏制柑橘黃龍病擴散蔓延的有效途徑之一。然而，由于長期不合理的使用殺蟲劑使得柑橘木虱對一些常用殺蟲劑產生了抗藥性。在中國、美國及全球其他柑橘產區(qū)均有柑橘木虱抗藥性的報道。因此，針對抗藥性的研究可為高效防控柑橘木虱指明方向。擬除蟲菊酯是一類作用于昆蟲神經系統(tǒng)的殺蟲劑，能有效控制衛(wèi)生害蟲以及農業(yè)害蟲。該類殺蟲劑的作用靶標為節(jié)肢動物的鈉離子通道，是一種在興奮性細胞中起始并傳遞動作電

2、位的跨膜蛋白。擬除蟲菊酯優(yōu)先與開放狀態(tài)的鈉離子通道結合并使通道張開的狀態(tài)延長，從而使昆蟲癱瘓并不久死亡。鈉離子通道的非同義突變會降低昆蟲對擬除蟲菊酯的敏感性。同時，鈉離子通道可變外顯子的組合也會影響昆蟲對擬除蟲菊酯的敏感性。轉錄組學是研究功能基因的一種方法，其已廣泛應用于多個領域。利用它高通量的特性，可以獲得研究所需要的重要的基因。據(jù)此，本學位論文以柑橘木虱為研究對象，在明確其田間種群對常用藥劑敏感性水平的基礎上，測定了寄主植物對其體內

3、解毒代謝酶活性的影響，克隆獲得了柑橘木虱的鈉離子通道基因的序列并預測了與抗藥性有關的突變位點，系統(tǒng)分析了鈉離子通道基因可變外顯子的組合及其在不同生長發(fā)育階段的頻率，最后利用轉錄組學方法挖掘出柑橘木虱與抗藥性相關基因，主要研究結果如下：
　　1美國佛羅里達州柑橘木虱對殺蟲劑敏感性檢測
　　采用生物測定的方法系統(tǒng)監(jiān)測了美國佛羅里達州5個縣的柑橘木虱田間種群對7種常用殺蟲劑的敏感性水平。結果表明，不同地區(qū)柑橘木虱對藥劑的敏感性差異

4、很大。Lake Alfred的柑橘木虱對甲氰菊酯的敏感性顯著低于Winter Garden的柑橘木虱。La Belle地區(qū)的柑橘木虱對西維因、樂果和噻蟲嗪的敏感性顯著低于Fort Pierce的柑橘木虱。Fort Pierce地區(qū)的柑橘木虱對吡蟲啉的敏感性顯著低于La Belle的柑橘木虱。Winter Garden地區(qū)柑橘木虱對噻蟲嗪的敏感性顯著低于Fort Pierce的柑橘木虱?？傮w來看，柑橘木虱對殺蟲劑敏感性下降說明這些地區(qū)柑橘

5、木虱有潛在發(fā)展為抗性的風險。
　　2寄主植物對柑橘木虱主要解毒代謝酶活性的影響
　　采用離體酶活性測定的方法，分析了柑橘木虱分別飼養(yǎng)于3種寄主植物12代后其體內的酯酶（EST）、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）和P450的活性。結果表明，飼養(yǎng)于千里香上柑橘木虱的P450活性顯著高于飼養(yǎng)于夏橙和九里香上的柑橘木虱的P450活性，且后兩者之間沒有顯著差異。飼養(yǎng)于3種寄主植物上的柑橘木虱體內的EST活性均沒有明顯差異。飼養(yǎng)于千里香和九

6、里香上的柑橘木虱體內的GST活性顯著高于以夏橙為寄主飼養(yǎng)的柑橘木虱的GST活性，且前兩者之間無顯著性差異。測定柑橘木虱3個種群對甲氰菊酯的敏感性發(fā)現(xiàn)三者之間雖存在差異，但統(tǒng)計分析差異不顯著，分析發(fā)現(xiàn)這種差異與酶活性的差異一致。因此，不同寄主植物可能影響柑橘木虱體內的解毒代謝酶活性。
　　3柑橘木虱鈉離子通道的鑒定、分析及突變位點預測
　　克隆獲得了柑橘木虱鈉離子通道基因的cDNA全長序列。結合生物信息學分析和實驗驗證，明確了

7、柑橘木虱的鈉離子通道基因的36個外顯子。依據(jù)密碼子使用規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)，與昆蟲抗藥性相關的6個突變位點中，V410、M918和F1534是柑橘木虱最有可能發(fā)生突變的位點。同時在序列比對或克隆片段中鑒定出柑橘木虱鈉離子通道的可變外顯子j、i、a、b、f、k和l。
　　4柑橘木虱鈉離子通道基因可變外顯子的組合及其在不同生長發(fā)育階段的頻率
　　研究建立了一種新的可變外顯子在單分子中組合的探測方法，并將該方法命名為Variant-det

8、ecting PCR。利用該方法測定了柑橘木虱66個鈉離子通道單分子中可變外顯子的組合，發(fā)現(xiàn)了13種可變外顯子的組合。其中，可變外顯子j在卵中頻率最低，b在1齡幼蟲時頻率最高，可變外顯子f則從1齡到5齡若蟲的頻率逐漸降低。
　　5柑橘木虱轉錄組組裝、基因功能注釋及抗藥性相關基因挖掘
　　對柑橘木虱4個樣本進行轉錄組組裝，共成功組裝58,059條Unigene。進一步的生物信息學分析表明，有20,191條Unigene得到功能

9、注釋。其中，與抗藥性相關的基因包括細胞色素P450基因序列49條、 NADH脫氫酶基因序列46條、谷胱甘肽S-轉移酶基因序列16條、羧酸酯酶基因序列16條、鈣通道基因序列14條、過氧化氫酶基因序列9條、氯通道基因序列9條、GABA受體相關基因序列2條、ABC轉運蛋白相關基因序列84條和魚尼丁受體相關基因序列2條。
　　綜上所述，美國佛羅里達州柑橘木虱對殺蟲劑敏感性有不同程度的降低，存在抗性產生的風險，說明對柑橘木虱的管理需要實時監(jiān)

10、控其抗藥性水平，為科學用藥提供依據(jù)。柑橘木虱的寄主植物可能影響其體內的解毒代謝酶進而影響其對殺蟲劑的敏感性，因此柑橘木虱的抗藥性管理需要考慮寄主植物等因素。昆蟲對擬除蟲菊酯產生抗藥性往往由鈉離子通道基因多個點突變引起，且這些突變有疊加效應。如果在生物測定中未發(fā)現(xiàn)顯著的抗性，則可以通過檢測鈉離子通道的突變位點確定柑橘木虱是否對擬除蟲菊酯類殺蟲劑存在抗性的風險。柑橘木虱鈉離子通道的鑒定和突變位點的預測為今后在分子水平上快速檢測田間柑橘木虱抗