2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、甲型流感病毒曾在世界上多次發(fā)生大規(guī)模的流感暴發(fā)流行,目前對流感尚無特效藥物進(jìn)行治療,接種流感疫苗是易感者預(yù)防流感的最佳選擇,核酸疫苗是當(dāng)前流感疫苗研究的方向與熱點。流感病毒血凝素(hemagglutinin.HA)是流感病毒的主要保護(hù)性抗原,能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體,此類抗體具有中和病毒和防止病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的作用,可中斷病毒的復(fù)制。HA由HA1重鏈和HA2輕鏈相連構(gòu)成。HA的5個抗原決定簇主要都位于HA1區(qū),因而流感亞單位疫苗的靶標(biāo)就首

2、選HA1區(qū)。小鼠β-防御素2(mBD2)是一種內(nèi)源性的抗菌肽,對非成熟的DC細(xì)胞具有趨化作用,能活化APC,增強機(jī)體的免疫作用,因此可以作為一種天然的免疫佐劑。 本研究的目的:構(gòu)建mBD2與HAl融合的真核表達(dá)載體(pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1),并檢測其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá),觀察pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1免疫小鼠后對流感病毒攻擊的保護(hù)力,研究mBD2作為免疫佐劑的可行性。 方法:用PCR

3、技術(shù)分別從構(gòu)建好的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2和pcDNA3.1(+)/HA1中擴(kuò)增出mBD2與HAl基因片段,再用重疊延伸PCR法(overlap-PCR)將mBD2與HA1通過一段柔性多肽接頭Gly<,4>Ser融合為mBD2-HA1。將mBD2-HA1融合基因插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+),轉(zhuǎn)化感受態(tài)E coli JM109并篩選陽性克隆。經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定正確后,用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/m

4、BD2-HA1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,用課題組制備的兔抗流感病毒血清作為一抗,F(xiàn)ITC熒光素標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗,通過免疫熒光檢測融合蛋白的真核表達(dá)情況。為了研究重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1對甲型流感病毒的免疫保護(hù)作用,我們以SPF級BALB/c小鼠為實驗動物,用pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1、pcDNA3.1(+)/HA1和pcDNA3.1(+)質(zhì)粒DNA分別免疫小鼠,一共免疫兩次,每次間隔三周。在第二

5、次加強免疫前,用斷尾法從小鼠尾部取血;第二次免疫后10d(病毒攻擊后3d),再次取血,并收集血清檢測抗.HA抗體。加強免疫后一周,用致死量(10×LD50)滴鼻攻擊小鼠,觀測動物的體重變化及存活率。綜合以上幾個方面評價重組質(zhì)粒的免疫保護(hù)效果。 結(jié)果:PCR法分別從質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2和pcDNA3.1(+)/HA1中擴(kuò)增出了mBD2與HA1基因片段,并且用重疊延伸PCR法成功將mBD2與HAl通過一段柔性多肽接頭

6、Gly<,4>Ser融合為mBD2-HA1。重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1經(jīng)雙酶切電泳后出現(xiàn)大小約1.2kb的目的條帶,PCR鑒定也出現(xiàn)了相同大小的條帶,目的片段經(jīng)測序和將測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對,證實了克隆片段是正確的。免疫熒光檢測結(jié)果表明重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1體外實驗?zāi)軌蛟贖EK293細(xì)胞中表達(dá)mBD2-HA1的融合蛋白。動物實驗結(jié)果表明,pcDNA3.1(+)空質(zhì)粒對照組的小鼠7d內(nèi)全

7、部死亡,pcDNA3.1(+)/HA1免疫組的小鼠保護(hù)率為50%,而pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1組的小鼠保護(hù)率為90%;與單獨免疫pcDNA3.1(+)/HA1相比,mBD2-HA1融合基因DNA免疫小鼠后,誘導(dǎo)出了更高的抗-HA抗體,保護(hù)率也更高,并且體重丟失明顯減少。 結(jié)論:本研究成功構(gòu)建了mBD2-HA1融合基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1,該質(zhì)粒能在真核細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白;經(jīng)動物實驗

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