日本血吸蟲Dna J-類似蛋白基因原核、真核表達載體的構(gòu)建及其對小鼠的保護性免疫作用研究.pdf

1、目的：擴增日本血吸蟲新基因SjDnaJ-類似蛋白基因；構(gòu)建pWR450-1/SjDnaJ類似蛋白基因原核表達載體并進行表達；構(gòu)建pcDNA3.1(+)/SjDnaJ-類似蛋白核酸疫苗，初步研究該核酸疫苗對BALB/c小鼠誘導(dǎo)的免疫保護性作用。 方法：根據(jù)新基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果，選擇SjDnaJ-類似蛋白作為研究對象，用PRIMER5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物并合成，PCR擴增SjDnaJ-類似蛋白基因，將PCR產(chǎn)物純化后與pU

2、Cm-T載體連接，經(jīng)藍白篩選、雙酶切和PCR鑒定后，亞克隆入pWR450-1原核表達載體及pcDNA3.1(+)真核表達載體中，經(jīng)抗生素(氨芐)篩選、雙酶切鑒定、PCR鑒定及測序鑒定后，將構(gòu)建的pWR450-1/SjDnaJ-類似蛋白基因重組體于大腸埃希菌中以IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE及Westernblotting鑒定表達情況；構(gòu)建的pcDNA3.1(+)/SjDnaJ-類似蛋白基因重組質(zhì)粒經(jīng)大量擴增后，注射到BALB/c小鼠

3、后腿股四頭肌肌肉組織中，每2周免疫一次，共免疫3次，末次免疫后2周，用日本血吸蟲尾蚴感染BALB/c免疫小鼠，42天后剖殺，計算肝臟蟲卵以及成蟲數(shù)，并用PCR、免疫組化法、ELISA等方法對SjDnaJ-類似蛋白基因在小鼠體內(nèi)的表達、穩(wěn)定性以及對小鼠的保護性作用等進行研究。 結(jié)果：構(gòu)建了pWR450-1/SjDnaJ-類似蛋白基因重組原核表達載體，并在大腸埃希菌TG1中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達。構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/SjDn

4、aJ-類似蛋白基因真核表達重組體，免疫BALB/c小鼠后，提取重組質(zhì)粒組小鼠后腿股四頭肌的總DNA，PCR擴增在一定時期內(nèi)能檢測到SjDnaJ-類似蛋白基因；免疫組化實驗顯示SjDnaJ-類似蛋白基因可在免疫小鼠肌肉中表達；末次免疫14天后，重組質(zhì)粒組小鼠血清中NO含量較其它對照組高；以Sj全蟲抗原處理體外培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細胞，重組質(zhì)粒組細胞增殖與空載體組和NS組比有顯著性差異(P＜0.05)；ELISA法分別檢測第1、2、3次免疫后1

5、4天各組小鼠血清中特異性抗體，結(jié)果顯示與對照組相比，重組質(zhì)粒組攻擊感染前抗體滴度較前提高；重組質(zhì)粒組小鼠經(jīng)三次免疫后產(chǎn)生了較高水平的特異性抗體，血清抗體滴度為1：12800；攻擊感染前以及攻擊感染42天后檢測各組小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清IFN-γ的含量，結(jié)果顯示以不同刺激物刺激，重組質(zhì)粒組在攻擊感染前IFN-γ含量均明顯高于NS與空載體對照組；攻擊感染42天后，重組質(zhì)粒組IFN-γ含量較感染前低，但仍高于NS與空載體對照組。用日本血吸蟲尾

6、蚴感染BALB/c免疫小鼠42天后剖殺，計算出實驗組肝臟蟲卵減卵率為38.6％，減蟲率為35.3％，免疫后小鼠可產(chǎn)生一定的抗日本血吸蟲尾蚴攻擊感染的作用。 結(jié)論：成功擴增日本血吸蟲DnaJ-類似蛋白基因，構(gòu)建了pWR450-1/SjDnaJ-類似蛋白基因原核表達載體，并于大腸埃希菌中表達；成功構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/SjDnaJ-類似蛋白基因真核表達重組體；pcDNA3.1(+)/SjDnaJ-類似蛋白核酸疫苗接種BALB