捻轉(zhuǎn)血矛線蟲肌動蛋白DNA疫苗的免疫保護性實驗與醛縮酶特性的研究.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Haemonchus contortus)屬毛圓科(Trichostrongylidae)血矛屬(Haemonchus)線蟲,是羊(山羊、綿羊)的主要胃腸道寄生蟲之一,常常導(dǎo)致羊特別是羔羊貧血、消瘦、甚至死亡,造成重大經(jīng)濟損失。目前的主要防治方法是使用抗蠕蟲藥,但由于蟲體抗藥性的產(chǎn)生和蔓延,使得傳統(tǒng)的化學(xué)藥物防治方法受到了嚴重挑戰(zhàn),隨著公眾對公共衛(wèi)生關(guān)注程度的提高以及人們對綠色食品的需求不斷擴大,藥物殘留和藥物污染問題已成

2、為限制藥物使用和開發(fā)的重要因素。因此,通過研究免疫學(xué)方法來防止該病已經(jīng)成為當前的迫切需要。
　　 本研究進行了捻轉(zhuǎn)矛線蟲肌動蛋白(Actin,ACT)DNA疫苗免疫保護實驗；同時克隆了捻轉(zhuǎn)矛線蟲醛縮酶(Aldolase,ALD)的全長序列。主要工作如下:
　　 1.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲肌動蛋白DNA疫苗的構(gòu)建與體內(nèi)表達情況的檢測
　　 利用DNA重組技術(shù),構(gòu)建了pVAX1-ACT DNA疫苗。酶切鑒定正確后,免疫小鼠,1

3、周后取肌肉注射部位、非注射部位組織,用RT-PCR和Western-blot檢測DNA疫苗的表達情況。RT-PCR檢測結(jié)果顯示,小鼠注射部位肌肉所擴增出的目的條帶大小約為1131bp,非注射部位中未能檢測到目的條帶,從而說明重組質(zhì)粒在注射部位可以成功轉(zhuǎn)錄；Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),在注射部位檢測到大小為41kD的目的蛋白的條帶,而非注射部位未能檢測到目的蛋白的條帶；這些結(jié)果說明本試驗成功構(gòu)建了pVAX1-ACT DNA疫苗,

4、為下一步的動物保護性試驗奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲肌動蛋白DNA疫苗的免疫保護性實驗
　　 使用DNA疫苗pVAX1-ACT,對9-10月齡山羊做了免疫保護性試驗。健康山羊15只,隨機分成3組,每組5只。其中一組每次免疫100μg pVAX1-ACT,其他兩組為不攻蟲對照組和攻蟲對照組。在試驗山羊的背部皮下多點注射免疫,兩個對照組用1ml PBS代替DNA疫苗,共免疫兩次,間隔2周。pVAX1-ACT免疫組和攻

5、蟲對照組山羊于第二次免疫14天后口腔接種5000條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第三期感染性幼蟲。從攻蟲后第22至34天,每隔一天采集糞便,蟲卵計數(shù).攻蟲后35天,屠宰山羊,剖解皺胃,分離雌雄蟲體,分別計數(shù)。使用DNA疫苗pVAX1-ACT對山羊做免疫保護性試驗的同時,采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法,測定了所有試驗山羊血清特異性免疫球蛋白IgG滴度、血清以及胃粘膜表面和胃粘膜組織勻漿中特異性IgA濃度。在免疫前、初免后14d,二免后14d、攻

6、蟲后14d和殺羊前對以下指標進行檢測:利用流式細胞術(shù)檢測了所有試驗山羊外周血中CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞和B淋巴細胞的變化；利用全自動電子血細胞分析儀對所有試驗山羊的外周血中嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞和血紅蛋白進行了檢測；利用ELISA試劑盒對血清細胞因子(IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-22)的濃度變化進行了檢測。
　　 結(jié)果顯示:DNA疫苗pVAX1—ACT免疫山羊后,ELISA檢

7、測結(jié)果表明血清IgG、IgA在首免后14天達到較高水平,二免后抗體水平進一步升高；殺羊后檢測胃粘膜表面(MS)與胃粘膜組織勻漿(MH)的IgA,發(fā)現(xiàn)胃粘膜組織勻漿具有較高的滴度。在免疫前、初免后14d、二免后14d、攻蟲后14d和殺羊前各項檢測結(jié)果表明:攻蟲前,免疫組山羊CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞水平、B淋巴細胞水平顯著高于不攻蟲對照組。免疫組IL-4水平顯著上升,IFN-γ水平有所下降,但變化不明顯。TGF-β、IL-22

8、變化規(guī)律性不明顯。免疫組山羊的嗜酸性粒細胞濃度顯著高于不攻蟲對照組,單核細胞水平逐漸上升；各組山羊的血紅蛋白濃度沒有明顯差異。攻蟲后,免疫組和攻蟲對照組山羊CD4+T淋巴細胞水平、CD8+T淋巴細胞水平、B淋巴細胞水平顯著高于不攻蟲對照組。陽性對照組的IL-4含量急劇上升,在63天達到高峰,免疫組和陽性對照組IL-4濃度顯著高于陰性對照組。免疫組和攻蟲對照組山羊嗜酸性粒細胞濃度顯著高于不攻蟲對照組,免疫組和不攻蟲對照組的血紅蛋白水平顯著

9、高于攻蟲對照組。用5000條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲三期幼蟲攻擊后,pVAX1-ACT免疫組分別在雌蟲、雄蟲和成蟲總數(shù)上比陽性對照組顯著減少34.10％(P<0.05),31.98％(P<0.05)和33.11％(P<0.05)；陰性對照組未發(fā)現(xiàn)成蟲。pVAX1-ACT免疫組蟲卵減少率為34.4％,陰性對照組始終未檢測到捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵。說明pVAX1-ACT對抵御山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的感染具有一定效果。
　　 3.捻轉(zhuǎn)血矛線蟲醛縮酶特性的研究

10、
　　 根據(jù)GenBank上登錄的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲醛縮酶(Aldolase)基因EST序列(登錄號為CB016007,登錄長度為743bp股計基因特異性引物,分別利用5’RACE和3’RACE獲得該基因5’端未知區(qū)和3’端未知區(qū),從而拼接得到Aldolage基因的全長cDNA。將該序列遞交GenBank(登錄號為HQ529288)。分析發(fā)現(xiàn):該基因全長1235bp,含有最大開放閱讀框(ORF)為1098bp,5’非翻譯區(qū)(5’UTR

11、)長27 bp,3’非翻譯區(qū)(3,15TR)長110bp。根據(jù)Aldolage基因的全長cDNA設(shè)計1對特異性引物,以捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的總RNA為模板,采用RT-PCR技術(shù),擴增出1098bp的產(chǎn)物,與推導(dǎo)出的ORF長度一樣。BLAST分析后將該片段克隆到pET-32a(+)載體中,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3),以IPTG誘導(dǎo)表達融合蛋白。SDS-PAGE結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白在上清和包涵體中均有表達,分子量約58kDa。以自然感染