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文檔簡介
1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲是羊牛等反芻動物常見寄生蟲,給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大經(jīng)濟損失。隨著捻轉(zhuǎn)血矛線蟲基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組等工作的開展,尋找新型有效的防控措施成為可能。本實驗室已對自由生活階段的幼蟲進行了比較蛋白組學研究,發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白70(Heat shock protein70,Hsp70)在第三期幼蟲(L3)活化后上調(diào)表達,而過氧化氫酶(catalase)表達量顯著減少。為探索這兩個差異性表達蛋白在蟲體侵入宿主過程中的作用,本文對其基因進行了
2、克隆和原核表達,并對其部分生物學特性進行了分析。
1Hsp70基因的克隆、原核表達及生物學特性分析
根據(jù)GenBank中捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hsp70序列設(shè)計了一對特異性引物,克隆了該基因,測序正確后將其亞克隆至pET28a(+)載體。原核表達載體pET28a-Hsp70轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后用IPTG誘導,SDS-PAGE電泳顯示該基因成功表達,融合蛋白分子量約為75KD。Western blot結(jié)果顯示該重組蛋白可被人工
3、感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲山羊血清所識別。用免疫熒光技術(shù)檢測出該重組蛋白可與山羊外周血單個核細胞(PBMC)結(jié)合。該重組蛋白可以增強山羊PBMC分泌NO的能力。以重組蛋白抗大鼠血清為一抗,以含Cy3標記的山羊抗大鼠抗體作為二抗,對Hsp70在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌、雄蟲中的分布進行了分析,結(jié)果顯示該蛋白在雌雄蟲的腸道、肌肉和皮下組織中均有分布。
2過氧化氫酶的基因克隆、原核表達及生物學特性分析
用RT-PCR技術(shù)獲得了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲ca
4、talase基因,將測序正確的catalase基因片段克隆到pET28a(+)載體上,構(gòu)建原核表達載體pET28a-catalase并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導后,SDS-PAGE電泳顯該基因成功表達,融合蛋白分子量大小與預期一致。體外試驗發(fā)現(xiàn)該重組蛋白具有酶活性,且在37℃下活性最高。Western blot結(jié)果顯示重組蛋白可被人工感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲山羊血清所識別。免疫熒光試驗結(jié)果表明該重組蛋白可與山羊PBMC相結(jié)
5、合。重組catalase蛋白在體外可以促進山羊PBMC分泌NO。以重組catalase抗大鼠血清為一抗,以含Cy3標記的山羊抗大鼠抗體作為二抗,對catalase在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲雌、雄蟲中的分布進行分析,結(jié)果顯示catalase在雌雄蟲的腸道、肌肉和皮下組織中廣泛分布。
3應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制活化第3期幼蟲Hsp70基因的轉(zhuǎn)錄
針對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hsp70基因設(shè)計并合成了3對siRNA(S1-S3)和一對無關(guān)干擾RNA
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