Serratia marcescens SYBC-01產(chǎn)過(guò)氧化氫酶發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、過(guò)氧化氫酶(CAT)參與活性氧代過(guò)程，在清除超氧化物陰離子、過(guò)氧化氫和過(guò)氧化物，阻止或減少羥基自由基(Htydroxyradical)形成等方面發(fā)揮著重要作用。 本研究利用無(wú)機(jī)培養(yǎng)基，從無(wú)錫惠山上采集的土樣中分離得到一株產(chǎn)胞內(nèi)CAT活力較高的菌株SYBC-01。經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化初步鑒定為Serratia屬，并對(duì)其16SrDNA基因序列測(cè)定和比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該菌株與SerratiamarcescensDSM30121的16SrDNA基

2、因序列的同源性為99.9％，因此命名為SerratiamarcescensSYBC-01。 對(duì)菌株S.marcescensSYBC-01產(chǎn)CAT的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。確定其適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為(g/L)：可溶性淀粉12.5，酵母膏15，磷酸二氫鉀0.5，初始pH為8.0。適宜的發(fā)酵條件為：種齡為8h，裝液量為60mL/250mL，接種量為10％(v/v)，搖瓶發(fā)酵時(shí)間為12h，培養(yǎng)溫度為28℃。優(yōu)化前菌株S.m

3、arcescensSYBC-01的CAT酶活為480.20U/mL，優(yōu)化后其酶活達(dá)到1105.58U/mL，提高了1.30倍。 在菌株S.marcescensSYBC-01胞內(nèi)檢測(cè)到3個(gè)CAT同工酶。本研究將同工酶CAT2作為目標(biāo)CAT，通過(guò)硫酸銨-凝膠過(guò)濾層析-離子交換層析三步純化過(guò)程對(duì)其分離，最終得到電泳純酶蛋白，純化倍數(shù)為62.51，酶蛋白得率為32.06％。其天然分子量為140KDa，其分子構(gòu)型為同源二聚體。經(jīng)動(dòng)力學(xué)分析

4、確定該酶的表觀米氏常數(shù)Km為29.7mmol/L，最大反應(yīng)速度Vmax為80925.79U/mg蛋白。Mg2+和Ca2+對(duì)CAT2有激活作用，該酶能被疊氮化物和金屬鰲合劑等單功能過(guò)氧化氫酶抑制劑抑制，對(duì)乙醇和氯仿等有機(jī)溶劑有耐受性。在以愈創(chuàng)木酚作為電子供體測(cè)定過(guò)氧化物酶活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，該酶不顯示相應(yīng)的酶活性。所以CAT2為單功能過(guò)氧化氫酶。 純化后的CAT2的最適pH為7，在pH6-pH10范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，相對(duì)酶活均超過(guò)50％。C