唾液酸黏附素胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)及抗體活性研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是目前引起豬繁殖障礙的主要病原之一，在豬體內(nèi)主要感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophages，PAM)。與 PRRSV感染相關(guān)的受體主要有唾液酸粘附素(Sialoadhesin，Sn)、硫酸乙酰肝素(Heparin sulphate，HS)和 CD163分子受體。Sn

2、受體可以黏附 PRRSV并介導(dǎo) PRRSV的內(nèi)吞作用。本文通過(guò)原核表達(dá) Sn胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域重組蛋白及檢測(cè)重組蛋白抗體活性，為研究結(jié)合 PRRSV的 Sn受體胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的功能作用打下基礎(chǔ)。
　　 本試驗(yàn)從健康豬肺收集 PAM細(xì)胞，提取 PAM細(xì)胞總 RNA，分析 Sn受體基因胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域，用 RT—PCR方法擴(kuò)增出三個(gè)結(jié)構(gòu)域的基因片段，大小分別為1755bp、1773bp、1620bp，將這三個(gè)基因片段分別亞克隆到 PMD18-T

3、載體中，進(jìn)行序列測(cè)定。利用 DNAStar軟件分析了三個(gè)結(jié)構(gòu)域的拼接序列與 Genbank上發(fā)表的 Sn受體胞外區(qū)核苷酸序列的同源性，結(jié)果為99.1％～99.5％。
　　 根據(jù)唾液酸黏附素受體基因序列，設(shè)計(jì)了3對(duì)5’端帶有 EcoR I酶切位點(diǎn)，3’端帶有Not I酶切位點(diǎn)的特異表達(dá)引物。根據(jù)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出三段基因，大小分別為1755bp、1773bp和1620bp。將所擴(kuò)增出的基因片段分別亞克隆到原核表達(dá)載體 pET32a中

4、，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒 PET—dSn1，PET-dSn2，PET—dSn3。在 IPTG的誘導(dǎo)下成功表達(dá)，獲得了分子量大小分別約為58KD、59KD、54KD的重組蛋白 rdSn1、rdSn2和 rdSn3，與預(yù)期的蛋白分子量相符；通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件，大量表達(dá)重組蛋白，用尿素法對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化與復(fù)性。純化重組蛋白經(jīng) SDS—PAGE電泳鑒定，目的蛋白的純度分別達(dá)到85％、76％、87％。用3種純化蛋白分別免疫小鼠，制備抗重組蛋白 rd

5、Sn1、rdSn2和 rdSn3的多克隆抗體，經(jīng)間接 ELISA檢測(cè)，效價(jià)均為1：400。將特異性多抗做免疫印跡，結(jié)果顯示制備的多抗可以與各自的重組蛋白特異性結(jié)合，表明表達(dá)的重組蛋白具有較好的免疫原性。
　　 在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng) PAM細(xì)胞，24 h后分別將抗 rdSn1、rdSn2、rdSn3血清及其混合血清加入 PAM細(xì)胞，封閉1 h后接種 PRRSV，培養(yǎng)72 h后用 RT—PCR檢測(cè) PAM中 PRRSV。同時(shí)用健