唾液酸近氨基端結(jié)構(gòu)域功能及脂多糖對PRRSV誘導IFN-a的影響研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起的一種豬的病毒性傳染病。PRRSV在體內(nèi)主要入侵單核/巨噬細胞,研究表明這與豬肺泡巨噬細胞上的病毒受體密切相關(guān),唾液酸粘附素受體在PRRSV侵染PAM細胞的過程發(fā)揮關(guān)鍵作用。唾液酸粘附素受體胞外區(qū)參與PRRSV與PAM細胞的吸附,本試驗通過研究唾液酸粘附素受體近氨基端第一個結(jié)構(gòu)域在PRRSV侵染PAM細胞的過程中的作用,為探討唾液酸受體對PRRSV的內(nèi)吞作用打

2、下基礎(chǔ)；在自然條件下,豬感染PRRSV后往往繼發(fā)感染副豬嗜血桿菌等革蘭氏陰性細菌病,革蘭氏陰性菌在體內(nèi)會產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素,內(nèi)毒素在機體的抗病毒機制中所發(fā)揮的作用目前還不明確,通過研究LPS刺激健康PAM細胞及感染PRRSV的PAM細胞對IFN—α和病毒復制的影響,為進一步探討細菌內(nèi)毒素在誘導機體抗病毒免疫反應抑制中的作用打下基礎(chǔ)。
　　 從健康豬肺收集PAM細胞,提取總RNA,設(shè)計1對唾液酸枯附素受體近氨基端第一個結(jié)構(gòu)域的特異性

3、引物。用RT-PCR方法擴增出其近氨基端的第一個結(jié)構(gòu)域的基因片段,大小約為450bp,將這基因片段亞克隆到pET-32a載體中,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-Sn150。在IPTG的誘導下成功表達,獲得了分子量大小約為36.6KD的重組蛋白Sn150,與預期的蛋白分子量相符；通過優(yōu)化表達條件,大量表達重組蛋白,用尿素法對表達的蛋白進行純化與復性。用純化蛋白免疫小鼠,制備抗重組蛋白Sn150的多克隆抗體,經(jīng)間接ELISA檢測,效價為1:1280

4、0。將特異性多抗做免疫印跡,結(jié)果顯示制備的多抗可以與各自的重組蛋白特異性結(jié)合,表明表達的重組蛋白具有較好的免疫原性。
　　 根據(jù)GenBank收錄的PRRSV和β-actin基因序列設(shè)計特異性引物,以β-actin為內(nèi)參基因建立檢測PRRSV的相對熒光定量方法,該方法擴增產(chǎn)物形成單一的特異性溶解峰,擴增特異性較好。在24孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)PAM細胞,6h后將鼠抗Sn150血清加入PAM細胞,封閉1h后接種PRRSV,分別培養(yǎng)6h

5、、12h、15h、18h、24h后,收集細胞及上清,用建立的real-time PCR方法檢測PAM細胞中的病毒的mRNA水平,同時用健康PAM細胞作陰性對照。結(jié)果顯示,鼠抗Sn150特異性抗體封閉后試驗組PRRSV mRNA水平在各個時間段比對照組相應時間段的PRRSV mRNA水平明顯增高,抗Sn150的特異性抗體增強了PRRSV在PAM細胞內(nèi)復制,表明PRRSV進入PAM的過程可能存在更復雜的調(diào)節(jié)機制。
　　 將含200個

6、TCID50病毒液,接到24孔細胞培養(yǎng)板中的PAM細胞上,吸附4h后接入100ng/ml的LPS,同時設(shè)接毒對照和正常細胞對照,分別培養(yǎng)6h、12h、15h、18h、24h后,收集細胞及上清,用建立的real-time PCR方法檢測PAM細胞中的PRRSV mRNA復制拷貝數(shù)。結(jié)果顯示,LPS刺激PRRSV感染的PAM細胞,與未刺激PRRSV感染的PAM細胞相比,可以使PRRSV轉(zhuǎn)錄水平達到頂峰的時間推遲,PRRSV mRNA水平輕微

7、上調(diào),說明LPS可以增強PRRSV在PAM細胞內(nèi)的增殖。
　　 根據(jù)GenBank收錄的IFN-α基因序列設(shè)計特異性引物,以β-actin為內(nèi)參基因建立檢測IFN-α的相對熒光定量方法,該方法擴增產(chǎn)物形成單一的特異性溶解峰,擴增特異性較好。將含200個TCID50病毒液,接到24孔細胞培養(yǎng)板中的PAM細胞上,吸附4h后接入100ng/ml的LPS,同時設(shè)接毒對照和正常細胞對照,分別培養(yǎng)6h、12h、15h、18h、24h后,收集

8、細胞及上清,用建立的real-timePCR方法檢測PAM細胞中的IFN-α mRNA水平。結(jié)果顯示,與PAM健康細胞對照組相比LPS誘導健康PAM細胞在不同時間段的IFN-α mRNA水平無顯著變化,LPS刺激PRRSV感染的PAM細胞與未刺激的PRRSV感染的PAM細胞相比,IFN-α轉(zhuǎn)錄水平達到頂峰的時間推遲,并且IFN-α mRNA水平大幅度下調(diào),說明LPS抑制PAM細胞產(chǎn)生IFN-α；PRRSV感染PAM后與健康PAM細胞相比