中國(guó)旱獺去唾液酸糖蛋白受體H1和H2亞基糖識(shí)別域的克隆、原核表達(dá)及多克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、目的：本課題旨在構(gòu)建中國(guó)旱獺去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)H1和H2亞基糖基識(shí)別域原核表達(dá)質(zhì)粒，在宿主菌內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)后得到純化目的蛋白，免疫小鼠，制備多克隆抗體。 方法：應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，從中國(guó)旱獺肝組織中擴(kuò)增ASGPRCRDH1和CRDH2cDNA，利用引入的限制性酶切位點(diǎn)體外連接定向克隆到原核表達(dá)載體pRSET-B內(nèi)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用Ni2+親合層析純化目的蛋白，并通過(guò)Westernblot方法檢測(cè)目的蛋白的抗原性

2、。用純化的重組蛋白免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體，并采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、Westernblotting及免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)抗體的靈敏度和特異性 結(jié)果：1.通過(guò)PCR、酶切和核苷酸測(cè)序表明：成功構(gòu)建了中國(guó)旱獺去唾液酸糖蛋白受體H1和H2亞基糖基識(shí)別域原核表達(dá)質(zhì)粒pRSET-B.CRDH1和pRSET-B.CRDH2。 2.SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測(cè)分析表明，目的蛋白在表達(dá)菌

3、BL21(DE3)plysS內(nèi)可以高效表達(dá)，觀察到目的蛋白以包涵體的形式存在；并通過(guò)Ni2+親合層析獲得了高純度的目的蛋白。 3.利用目的蛋白免疫BALB/c小鼠獲得多克隆抗體，對(duì)其進(jìn)行性質(zhì)鑒定，證明多.抗具有較好的特異性和較高的效價(jià)。 結(jié)論：1、成功地構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pRSET-B.CRDH1和pRSET-B.CRDH2。 2、獲得的中國(guó)旱獺去唾液酸糖蛋白受體H1和H2亞基糖基識(shí)別域的多克隆抗體具有特異性較好

4、、效價(jià)較高等優(yōu)點(diǎn).。 本課題的創(chuàng)新點(diǎn) 1.國(guó)內(nèi)首次成功構(gòu)建了表達(dá)中國(guó)旱獺去唾液酸糖蛋白受體H1和H2亞基糖基識(shí)別域的原核表達(dá)質(zhì)粒pRSET-B.CRDH1和pRSET-B.CRDH2。 2.國(guó)內(nèi)首次利用變性的ASGPRCRDH1和CRDH2融合蛋白免疫小鼠獲得了兩株特異性好、效價(jià)高、敏感性強(qiáng)的多克隆抗體，在肝臟疾病的靶向治療研究中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。 本研究的意義 中國(guó)旱獺去唾液酸糖蛋白受體CRD