CD163和Sn受體胞外區(qū)功能結構域在PRRSV-ADE中的作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征疫病是我國重要的傳染病，豬繁殖與呼吸綜合征病毒是該病的致病病毒。該病毒感染后不僅造成豬只的免疫抑制現(xiàn)象，還能夠引發(fā)豬只的持續(xù)性感染。有研究表明FcγR介導的PRRSV-抗體感染性復合物感染巨噬細胞是引起PRRSV持續(xù)性感染的原因之一，然而該作用機制并不十分完善。我們的研究發(fā)現(xiàn)PRRSV-抗體感染性復合物感染巨噬細胞的過程可能和病毒受體也有關。通過研究CD163分子和Sn受體在PRRSV感染中的ADE作用，為進一步完善抗

2、體介導的PRRSV持續(xù)感染機制，對PRRS新型疫苗的研制具有重要的指導意義。
　　但是當前關于CD163分子和Sn受體在PRRSV入侵PAM細胞整個過程當中的分子機制以及PRRSV感染過程中ADE機制不是非常了解，PRRSV或者是PRRSV-抗體感染性復合物感染機體的過程也不清楚，也不確定CD163分子和Sn受體功能結構域發(fā)揮作用的具體位置。本試驗將CD163分子胞外區(qū)的九個結構域分為四個片段，即CD163-P1（SRCR1-2）

3、，CD163-P2（SRCR3-4），CD163-P3（SRCR5-6）和CD163-P4（SRCR7-9），將Sn受體胞外區(qū)的17個結構域分為9個片段，即Sn1（1~150aa），Sn2（137~228aa），Sn3（236~406aa），Sn4（413~594aa），Sn5（599~791aa），Sn6（796~979aa），Sn7（981~1150aa），Sn8（1170~1248aa），Sn9（1441~1631aa）。用已構建

4、好的CD163分子和Sn受體不同片段的結構域重組質粒轉化進入表達菌BL21（DE3）中進行原核表達，并用不同濃度的尿素對表達的重組蛋白進行純化。收集PAM細胞，鋪于細胞培養(yǎng)板中，使PAM細胞貼壁，然后用CD163和Sn不同片段的不同稀釋度的結構域重組蛋白與等體積的PRRSV或4倍稀釋的PRRSV-IgG感染性復合物混合作用1h后，再感染PAM細胞，并設置陰性對照組，實時定量PCR方法檢測PRRSV拷貝數(shù)，GraphPad Prism5軟

5、件對所得到的數(shù)據(jù)進行處理。
　　本研究首先從PRRSV抗原抗體檢測陰性豬的肺臟中收集PAM細胞，提取細胞總RNA，根據(jù)Sn（GenBank:JX070181.1)的基因序列及對Sn胞外區(qū)片段的劃分，分別設計一對包含Sn6片段和Sn8片段結構域的特異性引物，再用RT-PCR方法擴增出Sn6和Sn8兩個片段結構域基因，長度分別為735bp和567bp，并將含有結構域基因的這兩個片段亞克隆到載體PET-32a質粒中，成功得到重組表達載體

6、質粒PET-Sn6、PET-Sn8。將構建好的PET-Sn6和PET-Sn8重組質粒和實驗室已經保存的PET-CD163-P1,PET-CD163-P2,PET-CD163-P3，PET-CD163-P4，PET-Sn1，PET-Sn2，PET-Sn3，PET-Sn4，PET-Sn5，PET-Sn7和PET-Sn9重組質粒轉化到表達菌BL21（DE3）中，通過最佳IPTG誘導表達的時間和最適誘導表達的濃度，大量表達CD163-P1，CD

7、163-P2，CD163-P3和CD163-P4，Sn1,Sn2,Sn3,Sn4,Sn5,Sn6,Sn7,Sn8和Sn9重組蛋白，并用不同濃度的尿素洗滌純化重組蛋白，然后用紫外分光光度計測定蛋白濃度。
　　為了探索CD163和Sn受體功能結構域在PRRSV感染PAM過程中發(fā)揮什么樣的作用，將試驗一所制備的CD163-P1，CD163-P2，CD163-P3和CD163-P4，Sn1,Sn2,Sn3,Sn4,Sn5,Sn6,Sn7,

8、Sn8和Sn9結構域重組蛋白，分別用不加血清的1640營養(yǎng)液稀釋為2.0mg/mL,1.0mg/mL,0.2mg/mL三個不同的濃度，再分別與等體積的200個TCID50/0.1mL PRRSV病毒充分混勻后放置于37℃培養(yǎng)箱作用1h，再感染PAM細胞孵育1h后，補加營養(yǎng)液作用48h，同時設置陰性對照組，用已建立的絕對熒光定量PCR方法檢測感染細胞中PRRSV的拷貝數(shù)，并用GraphPad Prism5軟件對所得到的數(shù)據(jù)進行處理。由試驗

9、結果可以看出，與PRRSV單純感染PAM細胞組相比,CD163和Sn各片段不同稀釋度的結構域重組蛋白與PRRSV混合作用感染48h后，PRRSV的拷貝數(shù)均明顯低于對照組PRRSV的拷貝數(shù)，說明CD163和Sn各片段不同稀釋度的結構域重組蛋白與PAM細胞上的CD163和Sn受體存在競爭與PRRSV結合的作用,并且重組蛋白濃度越高,競爭抑制作用越明顯。在CD163各片段不同稀釋度的結構域蛋白中，2.0mg/mL濃度的各片段蛋白中CD163-

10、P1的抑制作用較明顯，1.0mg/mL濃度的各片段蛋白中CD163-P3的抑制作用較明顯，0.2mg/mL濃度的各片段蛋白中CD163-P2和CD163-P4的抑制作用較明顯，但各個濃度總體之間的規(guī)律不太明顯。在Sn各片段不同稀釋度的結構域蛋白中，Sn6和Sn8片段各個濃度的結構域重組蛋白的競爭抑制作用相比其它片段更明顯，表明Sn6和Sn8片段結構域可能在參與PRRSV感染PAM細胞中發(fā)揮主要作用，本試驗為進一步研究CD163分子和Sn

11、受體胞外區(qū)功能結構域在PRRSV感染PAM細胞的分子機制及PRRSV-ADE作用機制提供了一些參考依據(jù)。
　　在此基礎上，取2倍稀釋的豬PRRSV特異性IgG0.05mL與等體積的200個TCID50/0.1mL PRRSV（使用之前先用無血清的1640營養(yǎng)液稀釋2.5倍）病毒充分混勻后，再取試驗一所制備的CD163-P1，CD163-P2，CD163-P3和CD163-P4，Sn1,Sn2,Sn3,Sn4,Sn5,Sn6,Sn7

12、,Sn8和Sn9結構域重組蛋白，并分別用不加血清的1640營養(yǎng)液稀釋為2.0mg/mL,1.0mg/mL,0.2mg/mL三個不同的濃度，然后分別取各個不同濃度的重組蛋白0.1mL，充分混勻后放置于37℃培養(yǎng)箱作用1h，再感染PAM細胞孵育1h后，補加營養(yǎng)液作用48h，同時設置陰性對照組，用已建立的絕對熒光定量PCR方法檢測感染細胞中PRRSV的拷貝數(shù)，并用GraphPad Prism5軟件對所得到的數(shù)據(jù)進行處理。由試驗結果可以看出，與

13、單純PRRSV-IgG感染PAM細胞對照組相比,高濃度的CD163各片段的結構域重組蛋白與PAM細胞上的CD163受體存在競爭與PRRSV結合的作用,在PRRSV-IgG感染PAM細胞的過程中抑制PRRSV的增殖，且濃度越高抑制作用越明顯；而低濃度的CD163各片段的結構域重組蛋白與PRRSV-IgG作用一段時間后感染PAM細胞，發(fā)現(xiàn)PRRSV的拷貝數(shù)顯著升高，結果表明CD163-P1，CD163-P2,CD163-P3和CD163-P

14、4各片段結構域在PRRSV感染中的ADE作用規(guī)律并不明顯。與單純PRRSV-IgG感染PAM細胞對照組相比,高濃度的Sn各片段結構域蛋白對PRRSV-IgG侵入PAM后的增殖具有顯著的抑制作用，且濃度越高抑制作用越明顯；而低濃度的Sn各片段結構域蛋白中，Sn6和Sn8結構域蛋白與PRRSV-IgG混合作用一段時間后，PRRSV的增殖被抑制，而其他蛋白作用的PRRSV拷貝數(shù)有所上升，間接說明了Sn6和Sn8片段結構域參與了PRRSV感染的

15、ADE作用，且Sn6和Sn8片段結構域同時作用時的ADE作用較明顯。表明Sn6和Sn8片段結構域能夠影響PRRSV-IgG在細胞內的復制增殖，暗示Sn6和Sn8片段結構域可能參與免疫復合物在細胞內的增殖，而且發(fā)揮主要功能作用。本研究進一步探討了CD163分子和Sn受體胞外區(qū)功能結構域在PRRSV感染中的抗體依賴性增強作用，為深入研究PRRSV-抗體感染性復合物入侵宿主細胞的分子機制提供了理論依據(jù)，對PRRS新型疫苗的研制及抗病毒藥物的篩