pSn受體在PRRSV-ADE中的作用及PRRSV感染小鼠模型的探討.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus, PRRSV)引起的。表現(xiàn)為母豬生殖衰竭和仔豬、成年豬呼吸困難，是影響?zhàn)B豬業(yè)最大的傳染病之一。PRRSV易變異，是單股正鏈 RNA病毒，可引起豬的持續(xù)性感染和免疫抑制，具有抗原變異性、嗜

2、巨噬細(xì)胞性、抗體依賴性增強(qiáng)作用(Antibody-dependent enhancement，ADE)等特征，在豬體內(nèi)，PRRSV主要入侵肺泡巨噬細(xì)胞，這與豬肺泡巨噬細(xì)胞上的特異性病毒受體有關(guān)。受體是病毒侵入的首要門戶，目前在豬肺泡巨噬細(xì)胞上己被確認(rèn)的受體有3種：唾液酸粘附素(Sialoadhesin，Sn)、硫酸乙酰肝素(Heparin sulphate，HS)和CD163分子。HS協(xié)助PRRSV吸附到PAM細(xì)胞上，Sn受體介導(dǎo)PRR

3、SV的內(nèi)吞及吸附，CD163分子協(xié)助Sn受體內(nèi)吞并使PRRSV的囊膜與細(xì)胞膜融合后建立通道幫助PRRSV脫衣殼，將病毒基因組RNA釋放到細(xì)胞漿中。PRRSV與Sn受體的結(jié)合是實現(xiàn)內(nèi)吞的必要步驟。
　　本研究首先用在線軟件對豬唾液酸粘附素受體Sn的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽、蛋白肽的親水性、抗原指數(shù)、表面可能性及柔韌性、結(jié)構(gòu)域及基序進(jìn)行預(yù)測。確定豬Sn受體體外原核表達(dá)的可能性，在兼顧豬唾液酸粘附素受體結(jié)構(gòu)域的情況下將豬Sn受體分段原

4、核表達(dá)，制備抗相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體，運用DEAE-纖維素離子交換層析技術(shù)將制備的鼠源抗唾液酸粘附素受體血清純化，去除雜蛋白，純化血清中的免疫球蛋白IgG。
　　為確定豬唾液酸粘附素受體Sn在病毒感染中的作用，本研究獲得體外豬肺泡巨噬細(xì)胞，將制備純化的鼠抗豬Sn各結(jié)構(gòu)域的抗體分別封閉處理PAM細(xì)胞，PRRSV感染24h和48h后用已建立的PRRSVSYBR GreenII實時熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞中病毒的增殖情況。結(jié)果顯示，與

5、對照組鼠陰性IgG封閉PAM細(xì)胞相比，接種病毒24h及48h后，各段結(jié)構(gòu)域封閉后對病毒增殖的抑制作用不一。已有的報道證明Sn N段V-set結(jié)構(gòu)域在PRRSV感染中發(fā)揮重要功能，本實驗結(jié)果將Sn N段封閉后，病毒略有抑制作用但差異不顯著；軟件預(yù)測的Sn受體17個結(jié)構(gòu)域中第9、10、13段結(jié)構(gòu)域抑制作用較明顯；結(jié)構(gòu)域聯(lián)合封閉后對病毒的抑制作用顯著，說明唾液酸結(jié)構(gòu)的完整性對病毒感染更重要，單獨封閉的結(jié)構(gòu)域部分也有抑制作用，暗示這部分結(jié)構(gòu)域可

6、能有其特有的功能，可能與病毒的粘附有關(guān)，但更需要重復(fù)試驗與研究。
　　在此基礎(chǔ)上，我們制備了不同濃度的感染性免疫復(fù)合物，探索Sn受體和CD163分子在感染性免疫復(fù)合物感染宿主靶細(xì)胞中是否發(fā)揮作用，當(dāng)感染性免疫復(fù)合物做2倍和4倍稀釋時，Sn各結(jié)構(gòu)域混合封閉組與對照組相比病毒拷貝數(shù)下降，差異顯著；當(dāng)感染性免疫復(fù)合物做8倍稀釋時，Sn各結(jié)構(gòu)域混合封閉組與對照組相比略高，但差異不顯著；將Sn受體和CD163分子聯(lián)合封閉處理PAM細(xì)胞，48

7、h后病毒增殖的抑制作用比單獨封閉Sn受體或者CD163分子的抑制作用更明顯。單獨封閉Sn受體或CD163分子及聯(lián)合封閉Sn受體和CD163分子后，PRRSV-IgG組病毒含量不但沒有升高，反而下降，且聯(lián)合封閉下降更明顯，說明，Sn可以在一定程度上調(diào)節(jié)感染性免疫復(fù)合物對機(jī)體的作用，Sn受體和CD163分子在感染性免疫復(fù)合物進(jìn)入宿主靶細(xì)胞時具有協(xié)助和促進(jìn)作用。
　　有研究不同物種Sn受體介導(dǎo)PRRSV進(jìn)入細(xì)胞的可能性，除了豬Sn受體，

8、鼠Sn受體和人Sn受體也有結(jié)合PRRSV的能力。實驗操作中PRRSV抗原抗體雙陰性豬不易獲得，且PRRSV可能是小鼠乳酸脫氫酶增高癥病毒(LDV)變異種經(jīng)過中間宿主野豬獲得感染了家豬，本研究對PRRSV感染小鼠模型進(jìn)行了探討：將濃縮純化的PRRSV病毒通過滴鼻感染、皮下注射、尾靜脈注射免疫小鼠。在注射病毒后第2、4、6、8、10天處死，采集病料，收集小鼠的血清、脾臟、肺泡巨噬細(xì)胞。RNA提取、RT-PCR擴(kuò)增及PRRSV核酸檢測。結(jié)果顯