非肌肉肌球蛋白重鏈Ⅱ-A在PRRSV感染細(xì)胞過程中的作用研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)又名"藍(lán)耳病"。是由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的一種接觸性傳染病。該病以繁殖障礙、呼吸道疾病、哺乳仔豬的高死亡率、免疫抑制和持續(xù)性感染等為主要特征。其病原具有典型的嗜單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特性,在體內(nèi),PRRSV主要感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(Porcine alveolar macrophages, PAM),在體外,

2、主要的易感細(xì)胞是非洲綠猴腎細(xì)胞MA-104及其衍生細(xì)胞Marc-145。PRRSV感染宿主細(xì)胞首先通過與細(xì)胞膜表面上的特異受體結(jié)合,利用細(xì)胞的內(nèi)吞作用而感染易感細(xì)胞。至今,已經(jīng)報(bào)道的與病毒感染相關(guān)的細(xì)胞蛋白由5個(gè),分別為:唾液酸粘附素(Sialoadhesin, Sn)、似肝磷脂蛋白(Heparan sulphate, HS)、波形蛋白(Vimentin)、清道夫受體(CD163)和CD151蛋白。研究顯示HS主要跟PRRSV與細(xì)胞的吸

3、附相關(guān),Sn則主要介導(dǎo)病毒的內(nèi)吞,CD163則發(fā)揮協(xié)助Sn內(nèi)吞,病毒脫衣殼和將基因組RNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中的作用,CD151能夠與PRRSV RNA3'UTR相互作用,轉(zhuǎn)染CD151表達(dá)載體至PRRSV非易感細(xì)胞能使非易感細(xì)胞感染PRRSV,而且抗CD151蛋白的血清能夠完全阻斷病毒感染。細(xì)胞蛋白NMHC-ⅡA與PRRSV之間的關(guān)系是基于本實(shí)驗(yàn)室用模擬PRRSV GP5抗原表位的單克隆抗獨(dú)特型抗體(Mab2-5G2),通過免疫共沉淀從PA

4、M和Marc-145中獲得的一個(gè)分子量約為230kD的蛋白質(zhì),后經(jīng)質(zhì)譜分析和測序確定為非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA(Non-myscle myosin heavy chain ⅡA, NMHC-ⅡA)。在動(dòng)物體內(nèi),非肌肉肌球蛋白Ⅱ(NMⅡ)重鏈有三種亞型,分別為:NMHC-ⅡA、NMHC-ⅡB、NMHC-ⅡC。此蛋白廣泛分布在整個(gè)生物體內(nèi),主要與細(xì)胞的吸附,遷移和胞質(zhì)分裂相關(guān)。目前關(guān)于NMHC-ⅡA功能的研究主要集中于針對其對細(xì)胞的生理功能研

5、究,而與病毒感染之間研究鮮有可見,作為病毒受體已經(jīng)有報(bào)道稱NMHC-ⅡA是HSV-1的一個(gè)功能性受體,另外PRRSV的重要受體蛋白CD163已經(jīng)被證明在淋巴細(xì)胞中可溶性的CD163可以與 NMHC-ⅡA結(jié)合,但關(guān)于CD163在 Marc-145細(xì)胞中是否與NMHC-ⅡA有相互關(guān)系,是NMHC-ⅡA和CD163共同在病毒感染過程中發(fā)揮作用還是NMHC-ⅡA能夠另外獨(dú)立發(fā)揮作用目前還沒有報(bào)道證實(shí)。本研究針對NMHC-ⅡA與PRRSV之間的相

6、互關(guān)系進(jìn)行了以下幾方面的分析:
　　1、NMHC-ⅡA蛋白與PRRSV病毒粒子體外相互作用分析。
　　為了更加明確的分析NMHC-ⅡA與病毒的相互作用關(guān)系,我們通過免疫共沉淀方法提純Marc-145細(xì)胞內(nèi)的NMHC-ⅡA蛋白和通過原核表達(dá)純化NMHC-ⅡA截短蛋白PRA蛋白,將蛋白標(biāo)記到Dynabeads(免疫磁珠)上利用蛋白-病毒pull down技術(shù)對NMHC-ⅡA蛋白病毒之間的關(guān)系進(jìn)行分析。檢測結(jié)果顯示,NMHC-ⅡA

7、與 PRA蛋白均能捕獲病毒粒子,而對照組沒有出現(xiàn)病毒粒子檢測條帶。
　　2、抗NMHC-ⅡA蛋白血清對病毒的阻斷作用分析。
　　作為PRRSV的細(xì)胞受體CD163、Vimentin、Sn、CD151等蛋白的抗血清均能夠有效阻斷病毒感染,為了判斷NMHC-ⅡA作為一個(gè)潛在受體其血清是否也能夠阻斷病毒感染,我們利用通過免疫共沉淀提純的NMHC-ⅡA蛋白免疫小鼠,分離血清進(jìn)行PRRSV感染阻斷實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示血清在1:5稀釋時(shí)能

8、夠有效阻斷病毒感染細(xì)胞,阻斷效率達(dá)到80％,隨著稀釋度的增加阻斷效率逐漸降低,稀釋度達(dá)到1:20時(shí)對病毒的阻斷作用幾乎消失。
　　3、NMHC-ⅡA蛋白低表達(dá)細(xì)胞系的建立與病毒感染分析。
　　為了分析病毒感染過程中NMHC-ⅡA與PRRSV的相互關(guān)系,我們利用RNA干擾技術(shù),設(shè)計(jì)合成4條(miRNA-1、miRNA-2、miRNA-3、miRNA-4,)針對 NMHC-ⅡA基因的miRNA對NMHC-ⅡA基因表達(dá)進(jìn)行沉默,分

9、析NMHC-ⅡA表達(dá)量降低對PRRSV感染Marc-145的影響,同時(shí)設(shè)計(jì)無關(guān)的miRNA序列作為對照。通過熒光定量測定分析發(fā)現(xiàn)miRNA-4序列能夠有效降低NMHC-ⅡA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá);經(jīng)過抗生素和單克隆篩選獲得miRNA-4載體轉(zhuǎn)染能夠穩(wěn)定傳代的細(xì)胞株P(guān)-4,該細(xì)胞株的NMHC-ⅡA表達(dá)水平與對照細(xì)胞P-NC相比降低了47％。利用該細(xì)胞株進(jìn)行PRRSV感染實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示4℃條件下病毒吸附細(xì)胞的量沒有因?yàn)镹MHC-ⅡA蛋白表達(dá)量的降低

10、而產(chǎn)生顯著改變。但病毒感染后的增殖,通過TCID50測定發(fā)現(xiàn)NMHC-ⅡA低表達(dá)細(xì)胞的病毒滴度顯著下降,病毒在24、48、72、96h的滴度分別是對照細(xì)胞的57.9％、77.7％、86.8％和87.4％。結(jié)果證明NMHC-ⅡA表達(dá)量的降低能夠影響病毒的增殖。但是對病毒增殖的影響程度呈逐漸減弱趨勢。
　　4、NMHC-ⅡA蛋白與PRRSV在Marc-145細(xì)胞上的共定位分析。
　　為了更直觀的觀察NMHC-ⅡA蛋白與PRRSV

11、在病毒感染過程中的相互關(guān)系,我們在P-4、P-NC和Marc-145細(xì)胞上對病毒吸附和內(nèi)化等不同時(shí)期進(jìn)行固定,對NMHC-ⅡA蛋白和PRRSV進(jìn)行了雙熒光染色,利用共聚焦顯微鏡進(jìn)行共定位分析,判斷兩者之間在量上的相互關(guān)系以及病毒感染與時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果顯示,病毒對三種細(xì)胞的吸附?jīng)]有明顯差異,但病毒吸附后內(nèi)化的病毒量 P-4細(xì)胞要明顯低于對照細(xì)胞,該差異從內(nèi)化15min后開始出現(xiàn)。關(guān)于病毒在不同細(xì)胞上的內(nèi)化與時(shí)間的關(guān)系,通過觀察發(fā)現(xiàn),P-4

12、細(xì)胞與對照細(xì)胞相比較病毒內(nèi)化的時(shí)間明顯推遲,P-4細(xì)胞開始出現(xiàn)內(nèi)化的時(shí)間要比對照細(xì)胞晚15min左右。從P-4、P-NC和Marc-145細(xì)胞上都可以看到PRRSV的內(nèi)化過程是伴隨著NMHC-ⅡA蛋白的收縮而發(fā)生的,PRRSV從膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并向細(xì)胞核運(yùn)動(dòng)的時(shí)間相對較短,并且到達(dá)細(xì)胞核周圍一定距離后在一定時(shí)間內(nèi)位置相對不再變化。
　　5、NMHC-ⅡA蛋白低表達(dá)細(xì)胞生長曲線,細(xì)胞周期測定和有絲分裂觀察。
　　研究已經(jīng)證明非肌肉