非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重鏈B型羧基端蛋白在PRRSV感染細(xì)胞過程中的作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的高度接觸性傳染病。該病主要引起妊娠母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各年齡段豬的呼吸道癥狀和高死亡率。PRRSV進(jìn)入Marc-145細(xì)胞的過程是依賴受體進(jìn)行的，目前已鑒定出在細(xì)胞上存在PRRSV的4個(gè)受體:硫酸乙酰肝素(heparin sulfate.HS)、唾液酸粘附素(sialoadhesin.Sn)、CD 163分子和波形蛋白Vimtin。HS，

2、Sn和CD 163三者之間的關(guān)系大體為:HS主要作用是吸附PRRSV到PAM細(xì)胞上，Sn介導(dǎo)PRRSV的內(nèi)吞。CD 163和波形蛋白可能起協(xié)助Sn內(nèi)吞、PRRSV脫衣殼和將病毒基因組RNA釋放到細(xì)胞漿的作用。
　　 研究團(tuán)隊(duì)制備了針對(duì)PRRSV GP5 抗體的單克隆抗獨(dú)特型抗體（Mab2-5G2），并利用Mab2-5G2 從PAM和MA-104 細(xì)胞中提取出非肌肉肌球蛋白II 型重鏈A蛋白（NMHC II-A）。隨后的研究證實(shí)N

3、MHC II-A和NMHC II-B（NMHC II的不同亞類）均與PRRSV 感染細(xì)胞有關(guān)。為了更加深入的研究PRRSV 病毒感染細(xì)胞的機(jī)制，本為以非肌肉肌球蛋白II 型重鏈B（NMHC II B）羧基端為研究對(duì)象，進(jìn)行了以下三部分的實(shí)驗(yàn)：
　　 第一，為了得到能夠特異性識(shí)別NMHC II-B的單克隆抗體，根據(jù)Marc-145 細(xì)胞上NMHC II-B 羧基端的蛋白質(zhì)序列，合成多肽，免疫Balb/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0

4、骨髓瘤細(xì)胞融合，用ELISA 篩選陽性克??；制備腹水并純化；用間接ELISA 方法和IFA檢測(cè)純化抗體的特異性。結(jié)果表明獲得2 株能穩(wěn)定傳代并分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞系；2 株細(xì)胞系所產(chǎn)生的抗體能夠特異性的與NMHC II-B 羧基端蛋白反應(yīng)而且能夠與Marc-145 細(xì)胞產(chǎn)生特異性的結(jié)合。兩株單抗的制備及鑒定為以后研究易感細(xì)胞上NMHCII-B 與PRRSV 感染的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二，提取Marc-145 細(xì)胞的總

5、RNA，用RT-PCR的方法克隆出Marc-145 細(xì)胞上NMHC II-B 羧基端長(zhǎng)為804bp的基因PRB，并構(gòu)建pET-28a-PRB 重組質(zhì)粒。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta表達(dá)感受態(tài)中，用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)出大小約35KD的蛋白。將該蛋白純化并免疫Balb/c小鼠，得到特異性的抗體。用IFA 方法檢測(cè)復(fù)性的純化PRB蛋白能夠和Marc-145 結(jié)合；PRRSV 與復(fù)性的PRB蛋白孵育后再感染Marc-145 細(xì)胞，其感染能力顯著