激活型FcγRs在PRRSV感染中的作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV)引起的以妊娠母豬繁殖功能障礙以及不同年齡階段豬呼吸道癥狀為特征的病毒性傳染病。主要侵害肺泡巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞。PRRSV存在持續(xù)性感染、免疫抑制、抗體依賴增強(qiáng)作用(ADE)等免疫

2、特征。PRRSV感染ADE是通過IgG Fc受體(FcγR)介導(dǎo)的內(nèi)吞作用促進(jìn)病毒進(jìn)入巨噬細(xì)胞復(fù)制。FcγR是一類能夠特異親和免疫球蛋白IgG Fc片段的細(xì)胞表面分子，IgG Fc受體的表達(dá)能夠觸發(fā)和調(diào)節(jié)多種免疫學(xué)效應(yīng)，在機(jī)體免疫防御中起著極其關(guān)鍵的作用。豬IgG Fc受體主要有FcγRⅠ(CD64)，F(xiàn)cγRⅡ(CD32)、FcγRⅢ(CD16)三類分子組成。其中FcγRⅠ、FcγRⅢ是激活型FcγR，激活型受體主要是通過胞內(nèi)域的IT

3、AM基序或FcR-γ傳遞活化信號(hào)，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。本研究通過探討激活型FcγR（FcγRⅠ和FcγRⅢ）在PRRSV感染的免疫反應(yīng)中的作用以及不同的抗體在PRRSV感染PAM中的作用，為該病的防治和新型疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　本研究分別將抗PRRS特異性IgG(2.64mg/ml)和非特異性IgG(2.63mg/ml)作倍比稀釋，與等體積含200 TCID50/100μL的PRRSV Hn-1/06株病毒液混合，制備成一系列的感染性

4、免疫復(fù)合物(PRRSV-IgG)和陰性抗體-病毒混合液(PRRSV+IgG)，接種PAM細(xì)胞;同時(shí)將純化的豬陰性IgG(2.63mg/ml)和兔抗豬IgG(2.64mg/ml)等體積混合制備免疫復(fù)合物(IC)，分別與等體積含200 TCID50/100μL的PRRSV Hn-1/06株病毒液混合，制備成非感染性免疫復(fù)合物-病毒混合液(PRRSV+IC)，接種PAM細(xì)胞。接種24h后用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)PRRSV的mRNA水平。同

5、樣的方法，分別將2倍稀釋的PRRSV-IgG，PRRSV+IgG和4倍稀釋的PRRSV+IC接種PAM細(xì)胞;將純化FcγRⅡB IgG(550ug/ml)處理PAM細(xì)胞，制備的感染性免疫復(fù)合物和非感性免疫復(fù)合物處理PAM細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別檢測(cè)感染12、24、36和48h后不同時(shí)間段內(nèi)PRRSV的mRNA水平。結(jié)果顯示，一定濃度的PRRS特異性亞中和水平抗體，在感染48h時(shí)間段內(nèi)均能極顯著促進(jìn)PRRSV在PAM細(xì)胞中增殖;

6、而適當(dāng)劑量的免疫復(fù)合物，在感染48h時(shí)間段內(nèi)也均能促進(jìn)PRRSV在PAM細(xì)胞中增殖。PRRS特異性亞中和水平抗體和非感性免疫復(fù)合物在FcγRⅡ B被封閉的情況下均能顯著的促進(jìn)病毒增殖。結(jié)果表明，一定濃度的PRRS特異性亞中和水平抗體通過激活型Fcγ R途徑增強(qiáng)PRRSV在宿主細(xì)胞中的增殖;一定濃度的PRRS非特異性抗體及其形成的非感染性免疫復(fù)合物均通過激活型FcγR途徑增強(qiáng)PRRSV在宿主細(xì)胞中的增殖。
　　本研究采用將含有200

7、個(gè)TCID50的Hn-2/06PRRSV、脂多糖(100ng/m L)、鼠陰性IgG(550μg/ml)和純化鼠抗豬FcγRⅠ IgG（550μg/ml）接種PAM細(xì)胞;同時(shí)用純化鼠抗豬FcγRⅠ IgG（550μg/ml）和鼠陰性IgG(550μg/ml)處理PAM細(xì)胞后接種含有200個(gè)TCID50的Hn-2/06PRRSV，各組分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h、60h、72h后收集細(xì)胞及上清，同時(shí)設(shè)健康細(xì)胞對(duì)照組，用已經(jīng)建立的

8、絕對(duì)熒光定量PCR方法檢測(cè)接毒組PAM細(xì)胞中不同時(shí)間段內(nèi)PRRSV復(fù)制水平以及用相對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)各組PAM細(xì)胞中IFN-α、TNF-αmRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，Hn-2/06 PRRSV在感染PAM細(xì)胞后12-24h期間PRRSV促進(jìn)IFN-α的mRNA水平，36-72h期間PRRSV抑制IFN-α的mRNA水平;TNF-αmRNA水平在感染后12h-72h均下調(diào);用純化鼠抗豬FcγRⅠ IgG處理豬PAM后，選擇性激活豬PAM

9、細(xì)胞表面FcγRⅠ，數(shù)據(jù)顯示IFN-α、TNF-α mRNA水平顯著下調(diào)，豬FcγRⅠ選擇性激活能抑制宿主細(xì)胞的抗病毒因子水平;PRRSV感染中，選擇性激活豬PAM細(xì)胞表面FcγRⅠ后顯著抑制抗病毒因子IFN-α、TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平，說明PRRSV感染過程中豬FcγRⅠ選擇性激活更進(jìn)一步抑制了宿主細(xì)胞的抗病毒因子水平。
　　本研究采用將含有200個(gè)TCID50的Hn-1/06 PRRSV、月旨多糖(100ng/m L)、鼠陰性I

10、gG(550μg/ml)和純化鼠抗豬FcγRⅢ IgG(550μg/ml)接種PAM細(xì)胞;同時(shí)用純化鼠抗豬FcγRⅢ IgG（550μg/ml）和鼠陰性IgG(550μg/ml)處理PAM細(xì)胞后接種含有200個(gè)TCID50的Hn-1/06 PRRSV，各組分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h、60h、72h后收集細(xì)胞及上清，同時(shí)設(shè)健康細(xì)胞對(duì)照組，用已經(jīng)建立的絕對(duì)熒光定量PCR方法檢測(cè)接毒組PAM細(xì)胞中不同時(shí)間段內(nèi)PRRSV復(fù)制水平以及

11、用相對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)各組PAM細(xì)胞中IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，Hn-1/06 PRRSV在感染PAM細(xì)胞后12-24h期間PRRSV促進(jìn)IFN-α的mRNA水平，36-60h期間PRRSV抑制IFN-α的mRNA水平，之后IFN-α的mRNA水平恢復(fù)正常;TNF-αmRNA水平在感染后12h-72h均上調(diào)。用純化鼠抗豬FcγRⅢ IgG處理豬PAM后，選擇性激活豬PAM細(xì)胞表面FcγRⅢ，數(shù)據(jù)顯示IFN-α